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研究背景:乳腺癌是目前全球女性最常见的恶性肿瘤,发病率为全球女性恶性肿瘤之首,并且呈现逐年上升的趋势。现阶段,乳腺癌的治疗方式主要为手术、内分泌治疗、放化疗、分子靶向治疗等。这些治疗手段使得乳腺癌患者的死亡率有所下降,但仍然有部分患者在治疗5年内出现了复发和转移,这是导致乳腺癌患者死亡的主要原因。乳腺癌干细胞是乳腺癌细胞中存在的一小部分具有干细胞特性,能够自我更新、具有多向分化潜能的细胞。与乳腺肿瘤中的非干细胞相比,乳腺癌干细胞具有高侵袭转移性、高致瘤性、放化疗抵抗性以及缺氧抵抗性。乳腺癌干细胞常用的分子标记包括CD24、CD44、八倍体结合转录因子4(Octamer-binding transcription factor 4,OCT4)、乙醛脱氢酶1(Aldehyde dehydrogenase 1,ALDH1)、干细胞转录因子SOX2(Sex-determining region of Y chromosome(SRY)-related high-mobility-group box2,SOX2)等。目前的研究已经证实,乳腺癌干细胞在乳腺癌的发生、发展以及复发和转移中均发挥着重要作用。UBQLN1(Ubiquilin1)是高度保守的泛素样蛋白家族中的一员,其编码基因位于人类9号染色体(9q22),编码589氨基酸序列或者561氨基酸序列。UBQLN1的功能类似于一个传递蛋白,可以将多泛素化目标提供给特定的蛋白,并促进蛋白酶体的降解,尤其是在内质网相关蛋白降解(Endoplasmic reticulum-associated protein degradation,ERAD)的过程中。目前对UBQLN1的研究主要集中在神经系统疾病,认为其是蛋白质异常聚集所导致的神经系统疾病(如肌萎缩侧索硬化症、阿尔茨海默病和亨廷顿病)的致病关键因素。有关UBQLN1在调控肿瘤发生和发展过程中作用的研究尚且较少,其在乳腺癌发生发展过程中的作用及机制尚不十分明确。上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)是指上皮细胞失去上皮特性,通过特定程序转化为具有间质表型的细胞的生物学过程。EMT过程中最具特征的分子事件是E-钙粘蛋白(E-cadherin)表达减少,而N-钙粘蛋白(N-cadherin)和间叶标记物波形蛋白(Vimentin)的表达增多,一些转录因子如Slug,Twist,Snail1和ZEB1/2等通过直接或间接的方式调控E-cadherin等EMT相关基因表达的方式,诱导EMT过程的发生。EMT在胚胎发育等生理过程以及机体创伤修复等病理生理过程中均起到了十分重要的作用,EMT过程可促进肿瘤细胞的侵袭和转移,并且与肿瘤干细胞的生物学功能关系密切相关。目的:(1)探讨UBQLN1对人乳腺癌细胞凋亡、增殖、迁移和侵袭的影响;(2)探讨UBQLN1与人乳腺癌细胞上皮-间质转化过程的关系;(3)探讨UBQLN1与人乳腺癌细胞干性的关系;(4)探讨UBQLN1通过PI3K/Akt信号通路影响人乳腺癌细胞干性和上皮-间质转化过程的可能机制。方法:1.正常乳腺上皮细胞及乳腺癌细胞中UBQLN1表达水平的检测:选取正常乳腺上皮细胞株MCF-10A、管腔型乳腺癌细胞株MCF-7、基底型乳腺癌细胞株MDA-MB-231为实验对象,提取细胞蛋白,利用Western blot实验检测UBQLN1在这三组细胞中的表达水平。2.下调人乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231中UBQLN1的表达水平并验证下调效率:(1)利用Lipofectamine 2000,将化学合成的UBQLN1 si RNA以及对照无关序列(NC)转染乳腺癌细胞MCF-7以及MDA-MB-231,并通过q RT-PCR以及Western blot验证转染效率;(2)利用UBQLN1敲低慢病毒表达载体(sh UBQLN1)和对照无关序列慢病毒表达载体(sh-NC)感染乳腺癌细胞MCF-7以及MDA-MB-231,利用嘌呤霉素筛选出下调UBQLN1的稳定细胞株,并通过q RT-PCR以及Western blot进行验证。3.下调UBQLN1对乳腺癌细胞凋亡、增殖、迁移、侵袭的影响:(1)在乳腺癌细胞MCF-7以及MDA-MB-231的对照组和实验组中通过Western blot实验检测凋亡相关蛋白Caspase3(Cleaved)、Bcl2、Bax以及侵袭相关蛋白MMP2和MMP9的表达水平;(2)利用平板克隆实验、划痕实验、Transwell实验检测UBQLN1对乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231增殖、迁移、侵袭的影响。4.UBQLN1与乳腺癌细胞EMT过程的关系:(1)通过Western blot实验检测EMT相关蛋白E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail1、Twist在MCF-7以及MDA-MB-231两种细胞系对照组和实验组中的表达;(2)通过细胞免疫荧光检测MCF-7细胞对照组和实验组中E-cadherin、N-cadherin的表达情况。5.UBQLN1与乳腺癌细胞干性的关系:(1)Western blot检测乳腺癌细胞MCF-7以及MDA-MB-231中下调UBQLN1对乳腺癌干细胞标记分子ALDH1、OCT4、SOX2表达水平的影响;(2)通过免疫磁珠法从乳腺癌细胞系MCF-7中分选出乳腺癌干细胞亚群(CD44+/CD24low-)以及乳腺癌非干细胞亚群,提取乳腺癌干细胞与非干细胞的总RNA,通过q RT-PCR法检测目的蛋白UBQLN1在乳腺癌细胞MCF-7的干细胞亚群以及非干细胞亚群中m RNA水平的表达;(3)成球实验检测下调UBQLN1对乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231中干细胞球形成能力的影响。6.下调UBQLN1后通过Western blot和细胞免疫荧光检测乳腺癌细胞中PI3K/Akt信号通路相关蛋白PTEN、Akt、P-Akt的表达情况,并进行比较分析。结果:1.UBQLN1在MCF-10A、MCF-7和MDA-MB-231细胞系中均有表达,在两种乳腺癌细胞系中的表达高于正常乳腺上皮细胞系中的表达,其差异有统计学意义(P<0.01)。2.利用慢病毒下调乳腺癌细胞MCF-7及MDA-MB-231中UBQLN1的表达,利用嘌呤霉素筛选出UBQLN1低表达的MCF-7及MDA-MB-231稳定细胞株,并分别利用Western blot和q RT-PCR分别在蛋白水平和m RNA水平进行检测及验证,已成功建立下调UBQLN1的稳定细胞株(P<0.05)。3.UBQLN1对乳腺癌细胞增殖、迁移、凋亡和侵袭的影响,(1)平板克隆实验结果显示:在MCF-7和MDA-MB-231细胞中,下调UBQLN1的实验组细胞形成的细胞集落数量及大小均明显小于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05);(2)细胞划痕实验结果显示:在MCF-7和MDA-MB-231细胞中,与对照组相比,下调UBQLN1的实验组细胞划痕愈合速度明显小于对照组细胞,其差异具有统计学意义(P<0.01);(3)Transwell结果显示:在MCF-7和MDA-MB-231细胞中,下调UBQLN1的实验组细胞培养18小时后,穿膜数量显著少于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05);(4)Western blot结果显示:在MCF-7和MDA-MB-231细胞中,与对照组相比,下调UBQLN1的实验组细胞基质金属蛋白MMP2、MMP9表达均下降,差异具有统计学意义(P<0.01);凋亡相关蛋白Caspase3(Cleaved)、Bax增多,而抗凋亡蛋白Bcl2的表达减少,其差异具有统计学意义(P<0.05)。4.UBQLN1对乳腺癌细胞上皮-间质转化过程的影响,(1)Western blot检测乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231细胞中EMT相关蛋白表达的结果显示:与对照组相比,下调UBQLN1的实验组细胞中E-cadherin增多,而N-cadherin、Snail1、Vimentin、Twist减少,其差异具有统计学意义(P<0.05);(2)细胞免疫荧光检测乳腺癌细胞MCF-7中EMT相关蛋白表达的结果显示:与对照组相比,下调UBQLN1的实验组E-cadherin荧光亮度增强,而N-cadherin荧光亮度减弱,结果与Western blot结果相一致。5.UBQLN1与乳腺癌细胞干性的关系,(1)在乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231中,与对照组相比,下调UBQLN1的实验组细胞中ALDH1、OCT4、SOX2这三个干性标记物的表达均减少,其差异具有统计学意义(P<0.05);(2)免疫磁珠分选MCF-7细胞提取干细胞亚群及非干细胞亚群后相关实验结果显示:ALDH1在CD44+/CD24low-细胞亚群中的表达显著高于其在两组非CD44+/CD24low-细胞亚群中的表达,证明我们已经成功分选出了MCF-7干细胞群(P<0.01)。与非干细胞亚群相比较,UBQLN1在CD44+/CD24low-的干细胞亚群中显著高表达,其差异具有统计学意义(P<0.01);(3)成球实验结果显示:在MCF-7和MDA-MB-231细胞中,UBQLN1下调后,实验组细胞形成的干细胞球的数量及大小均显著低于对照组(P<0.05)。6.UBQLN1通过PI3K/Akt信号通路影响人乳腺癌细胞干性和EMT的可能机制,Western blot结果显示:在MCF-7和MDA-MB-231细胞中,与对照组相比,下调UBQLN1的实验组细胞中PTEN的表达明显增加,Akt的表达无明显改变,而P-Akt(ser473)的表达减少,其差异具有统计学意义(P<0.05)。细胞免疫荧光结果显示在乳腺癌细胞MCF-7中,UBQLN1低表达的实验组细胞中PTEN的荧光亮度增强,而P-Akt的荧光亮度减弱,结果与Western blot结果相一致。结论:1.UBQLN1可促进乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭;2.UBQLN1可抑制乳腺癌细胞凋亡过程;3.UBQLN1可促进乳腺癌细胞EMT过程;4.UBQLN1的表达水平与乳腺癌细胞干性呈正相关;5.UBQLN1可激活PI3K/Akt信号通路的信号转导,UBQLN1可能通过激活PI3K/Akt信号通路影响乳腺癌细胞干性和EMT等。