木薯广泛种植于热带亚热带地区,是热区主要的粮食作物之一,全世界约有10亿人以木薯作为主要粮食,是世界公认的一种很有发展潜力的可再生能源作物。木薯细菌性枯萎病是危害木薯产量的一种严重病害。目前,所报道的木薯抗病相关的基因鲜见,因此,发掘木薯抗病相关基因,培育木薯抗病新品种,是促进木薯产业绿色发展的重要途径。褪黑素在植物中起着多重作用,包括花期、开花、种子萌发、根的发育及数量、果实成熟、衰老和逆境胁迫等。在本研究中,我们分离木薯中褪黑素合成相关基因,分析在不同处理下的表达谱,并研究其功能和信号网络。获得的主要结果如下:1.本实验对华南124号木薯7个褪黑素合成相关基因进行了系统分析,实时定量PCR表明,这些基因通常受病原菌(Xanthomonas axonopodis pv.manihotis/Xam)和过氧化氢(H202)诱导表达。将7个褪黑素合成相关基因连接到pEGAD载体,通过农杆菌介导法瞬时转化入烟草叶片,将注射过农杆菌部位的叶片在共聚焦显微镜下观察其亚细胞定位,发现这7个基因都定位于细胞核和细胞质。瞬时转化入烟草叶片后,发现这些基因对防御相关基因的表达有显著影响,触发烟草叶片胼胝体沉积,对Xam有不同程度的抑制作用。表明这些基因在植物的先天免疫中发挥作用。2.将7个褪黑素合成相关基因在烟草中瞬时转化检测褪黑素含量的变化,发现超表达MeTDC2、MeASMT2和MeASMT3的褪黑素含量比其余4个的高,选这三个酶筛选互做蛋白。通过酵母双杂交分别鉴定出11、21和9个与MeTDC2、MeASMT2和MeASMT3的形成复合体的蛋白。值得注意的是,MeWRKY20和MeWRKY75能与这3种酶的形成复合体,并进一步通过酵母双杂交和体内双分子荧光互补证明。在木薯原生质体中过表达MeTDC2、MeASMT2、MeASMT3、MeWRKY20和MeWRKY75,能激活 MeWRKY20 和 MeWRKY75 W-box 的转录活性。3.通过激活木薯原生质体中的启动子活性和染色质免疫沉淀(ChIP)以及体外电泳迁移率漂移分析(EMSA)证实MeWRKY79和热激转录因子20(MeHsf20)分别与MeASMT2 启动子中的 W-box 和 HSE 元件结合。MeWRKY79、MeHsf20、MeASMT2的表达量均受22氨基酸鞭毛蛋白肽(flg22)和木薯细菌性枯萎病病原菌(Xam)诱导。与MeASMT2的表型一样,MeWRKY79和MeHsf20在烟草叶片中的瞬时表达提高了烟草的抗病性。通过病毒诱导的基因沉默(VIGS),发现沉默MeWRKY79和MeHsf20的木薯中,MeASMT2的表达量和褪黑素含量较低,对Xam更敏感,但外源褪黑素处理可恢复抗病性。综上所述,这些结果表明,MeASMT2在植物抗病性中是MeWRKY79和MeHsf20的靶标。本研究鉴定了木薯褪黑素合成基因的上游转录因子,从而扩展了我们对植物防御中褪黑素合成复杂调控的认识。4.基因表达分析MeRAVs的表达量受Xam诱导,且MeRAV1和MeRAV2特异定位在植物细胞核中。共沉默MeRAV1和MeRAV2植株对Xam更敏感,但外源褪黑素处理可恢复抗病性。通过VIGS和木薯叶原生质体过量表达,发现MeRAV1和MeRAV2对褪黑素生物合成基因和内源褪黑素水平有正调控作用,且能与MeTDC2、MeT5H和MeASMT1启动子中的CAACA元件和/或CACCTG序列结合。综上所述,本研究首先鉴定了 7个木薯褪黑素合成相关基因,解析了其在木薯抗病中的功能;其次筛选部分褪黑素合成相关基因的互作蛋白,并鉴定上游转录因子及结合位点;最终拓展了木薯褪黑素参与植物防御反应中的新机制,从而扩展我们对植物褪黑激素信号传导和植物防御中褪黑素复杂调控的认识。该研究结果为培育木薯抗病品种提供理论依据和候选基因资源。