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乳腺癌是当前女性发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。肿瘤转移是导致患者预后不良的主要因素,而淋巴结是乳腺癌转移最常见的部位,淋巴结阳性患者预后不佳早已成为共识。乳腺癌细胞侵袭迁移进入微淋巴管是乳腺癌淋巴转移的早期事件,但其机制尚不完全清楚。肿瘤微淋巴管转移的关键步骤包括肿瘤细胞向微淋巴管侵袭迁移以及微淋巴管生成。近年来的研究发现CC类趋化因子受体成员CCR7与其配体CCL21的相互作用在包括乳腺癌在内的多种肿瘤的淋巴转移中发挥重要作用。肿瘤干细胞（cancer stem cells, CSCs）是肿瘤发生的“种子”细胞和复发转移的根源,且早期发生转移的肿瘤细胞多是CSCs,而我们的前期研究发现乳腺癌干细胞中高表达CCR7。因此,CCL21/CCR7在介导乳腺癌干细胞侵袭迁移中的作用及其机制有待进一步研究。获得大量高纯度的乳腺癌CSCs是进行上述研究的前提。目前研究多利用CSCs表达的分子标记通过流式细胞分选获得高纯度的干细胞,并在无血清低粘附条件下成球培养进行扩增。但是,长期成球培养能否维持CSCs的高纯度尚未可知。针对上述问题,本研究以人乳腺癌细胞系MCF-7为研究对象,首先分选、鉴定、扩增乳腺癌CSCs,检测培养过程中CSCs比例的变化,并建立合理的数学模型对其生长模式进行解释。然后以CCL21/CCR7为切入点,探讨乳腺癌CSCs向微淋巴管侵袭迁移的作用及其机制,以及诱导微淋巴管生成的可能作用和信号通路,以期深入认识肿瘤淋巴道转移的分子机制及乳腺癌CSCs的生物学特性,为进一步抗乳腺癌淋巴转移和抗乳腺癌CSCs治疗提供新的思路。实验方法和主要结果1.乳腺癌干细胞的分离和培养方法:利用流式细胞术分选MCF-7中CD44+CD24-/low表型的CSCs,在无血清条件下成球培养进行扩增和鉴定。在长期成球培养过程中测定细胞球中乳腺癌CSCs比例,并建立合理的数学模型来模拟长期成球培养中CSCs比例的连续变化,然后利用检测结果进行参数估计,并结合CSCs的生物学特性对参数进行解释。结果:MCF-7中CD44+CD24-/low细胞的比例为1.8%,分选后立即回测得到的CD44+CD24-/low MCF-7 CSCs的比例为96.2%。CSCs在无血清条件下悬浮培养能够得到体积较大且致密的细胞球。长期成球培养过程中,细胞球中MCF-7 CSCs的比例会逐渐下降,并最终稳定在与普通贴壁培养MCF-7细胞中CSCs相同的比例。构建的微分方程数学模型能够较好地模拟成球培养中CSCs的生长模式,通过对参数的估计和分析,长期成球培养细胞球中MCF-7 CSCs的比例逐渐下降的主要原因是CSCs的不对称分裂产生分化细胞以及分化细胞的增殖。同时,在成球培养条件下,极少部分的分化细胞也可以转化为CSCs。2. CCL21/CCR7介导乳腺癌干细胞侵袭迁移及其机制研究方法:免疫荧光染色和western blotting检测MCF-7和MCF-7 CSCs中CCR7表达差异。针对两个靶点设计构建CCR7 siRNA干扰慢病毒并验证其有效性。利用qRT-PCR、western blotting和ELISA检测MCF-7 CSCs及CCR7 siRNA干扰后的MCF-7 CSCs在加入或不加入CCL21培养时MMP2/9、Erk1/2及其磷酸化、p38及其磷酸化在mRNA、蛋白水平的表达及向胞外的分泌情况,检测Erk1/2或p38特异性抑制后对MMP2/9表达的影响。同时检测CCL21对各组MCF-7 CSCs迁移及侵袭能力的影响。结果:MCF-7 CSCs中CCR7表达水平明显高于MCF-7。成功构建两个CCR7 siRNA干扰慢病毒并转染到MCF-7 CSCs中,能够有效抑制MCF-7 CSCs中CCR7在mRNA和蛋白水平的表达。CCL21处理能够显著上调MCF-7 CSCs中MMP9表达以及Erk1/2和p38的磷酸化,而CCR7 siRNA干扰以及Erk1/2特异性抑制能够减弱CCL21诱导的MMP9表达上调。CCL21能够诱导高表达CCR7的MCF-7 CSCs迁移和侵袭能力增强。3. CCL21/CCR7对乳腺癌干细胞VEGF-C表达的影响及其机制研究方法:利用qRT-PCR、western blotting和ELISA检测MCF-7 CSCs及CCR7 siRNA干扰后的MCF-7 CSCs在加入或不加入CCL21培养时VEGF-C在mRNA、蛋白水平的表达水平及向胞外的分泌情况。结合第二部分研究结果发现CCL21处理能够促进MCF-7 CSCs中Erk1/2和p38的磷酸化,检测Erk1/2或p38特异性抑制后对VEGF-C表达的影响。结果:CCL21处理能够显著上调MCF-7 CSCs中VEGF-C在mRNA、蛋白水平的表达,并分泌到细胞外;而p38特异性抑制能够减弱上述作用。结论1.流式细胞分选可以获得高纯度的乳腺癌CSCs,但是长期成球培养不能维持CSCs的高纯度,其主要原因是CSCs的不对称分裂以及分化细胞的增殖。数学模型可以较好地模拟乳腺癌CSCs培养过程中生长、分化特点和规律,模型参数的分析可为进一步深入研究乳腺癌CSCs的生物学行为和可能的干预措施提供新的方法。2.乳腺癌组织及其周围的微淋巴管内的淋巴管内皮细胞分泌CCL21与乳腺癌CSCs中表达的CCR7相互作用,至少通过以下3条途径促进了乳腺癌CSCs向微淋巴管发生侵袭转移:①诱导乳腺癌CSCs发生迁移;②通过促进Erk1/2的磷酸化上调MMP9表达,降解肿瘤细胞周围及微淋巴管周围的细胞外基质,进一步促进乳腺癌CSCs的侵袭;③促进p38的磷酸化,从而上调细胞VEGF-C表达,进一步可能诱导淋巴管内皮细胞增殖迁移,从而促进微淋巴管生成。