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糖尿病是世界范围内发病率和死亡率最高的疾病之一。2015年IDF发表声明,全球成人糖尿病患病率已达8.8%,全球有415,000,000人患有糖尿病,20岁到79岁人群中有5百万人死于糖尿病及其并发症。其中90%的患者是2型糖尿病。2型糖尿病是一种复杂的代谢疾病,是由于胰岛素敏感性下降和胰腺β细胞功能障碍导致的,胰岛素敏感性逐渐恶化导致高血糖和β细胞功能障碍。随着胰腺β细胞功能减退,当不能再产生足够的胰岛素以弥补胰岛素敏感性不足,葡萄糖稳态遭到破坏,就会出现葡萄糖耐量减低,以致2型糖尿病的发生。2017年全国慢性非传染性疾病预防控制中心发布的对170,287人进行调查,发现糖尿病患病率达10.9%,糖尿病前期患病率为35.7%。糖尿病在世界范围内呈爆发性增长,糖尿病及糖尿病前期的防治刻不容缓。胰岛素抵抗与糖、脂等能量物质的代谢异常密切相关。铬（三价）（Cr3+）和镁（Mg2+）在能量物质代谢过程中发挥关键作用,其与胰岛素抵抗的关联已引起科研人员的极大兴趣。Cr3+是维持正常葡萄糖、胰岛素和脂肪代谢所必需的微量元素。铬摄入量不足可以增加患糖尿病和心血管疾病的危险性。镁是细胞内含量最丰富的第二大阳离子,作为高能磷酸化代谢途径酶的必需辅助因子参与能量代谢、蛋白合成和调节细胞膜的葡萄糖转运。微小RNA（microRNA,miRNA）是长度约为22个核苷酸的短链非编码RNA,主要是通过转录抑制作用或者mRNA的降解作用,导致沉默其靶基因的表达,从而实现其对靶基因的表达调控。研究表明,微小RNA可以通过其对靶基因的调控,影响糖耐量。目前有关铬和镁联合补充对糖耐量异常患者循环miRNA差异表达的报道较少。研究目的探讨铬和镁联合补充对糖耐量异常人群血糖的影响,观察循环miRNA表达谱的变化,筛查表达差异miRNA,验证其靶基因,探讨在糖尿病前期通过铬镁补充逆转疾病进程的可能的分子机制。为治疗糖耐量异常和预防糖尿病的发生提供新的靶点。研究方法1.研究对象:选取2015年1月-2015年12月期间于青岛大学第二临床医学院就诊的糖耐量异常（impaired glucose tolerance,IGT）患者（符合1999年WHO标准）及与IGT患者年龄相匹配的糖耐量正常人群。本研究分为三组,分别是正常对照组（10人）、安慰剂对照组（安慰剂组,60人）、铬（120μg/d）+镁（200 mg/d）组（铬镁干预组,60人）,干预时间为3个月。2.实验方法:铬镁干预组给予铬（120μg/d）+镁（200 mg/d）补充治疗。安慰剂对照组给予服用安慰剂。按照常规方法进行血压、体重和身高的测量。测定血糖、糖化血红蛋白、空腹胰岛素及血脂。3.RNA提取:每组随机抽取5例受检者10ml外周静脉血于美国BD公司的Vacutainer SSTTM采血管中。采用美国Qiagen公司的miRNeasy血清/血浆提取试剂盒提取循环miRNA。质控分析采用美国Agilent公司的生物分析仪2100系统进行,所用试剂盒为Agilent RNA 6000 Nano和小RNA试剂盒。4.微小RNA测序:采用Illumina Hiseq2000系统进行miRNA的测序,文库构建采用KAPA RNA Hyper Prep Kits,按照使用说明书进行操作。5.荧光定量PCR（qPCR）:miRNA的qPCR引物购于广州市锐博生物科技有限公司（ribobio）。采用SYBR法,Mastermix购于美国ThermoFisher公司。采用2-dd CT法进行数据分析,内参基因为RNU6B、miR-454、miR-425。6.miR-182-5p和miR-96-5p靶基因的预测分析:采用软件Target Scan（v6.2）、Miranda（2010-11-01）和Microcosm V5进行miR-182-5p和mi R-96-5p靶基因的预测,采用软件Venny tool（v2.0.2）进行上述三个预测软件共同靶基因的筛选。7.miR-182-5p和miR-96-5p功能富集分析:上述预测出的共同靶基因进行gene ontology（GO）与Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）信号通路分析,采用的软件为美国Arraystar公司的分析软件。8.靶基因验证:将miRNA的agomir或antagomir与带有报告基因的载体共同导入HIT-T15胰岛β细胞中,通过荧光强度值的变化来反应目的miRNA与预测靶基因的结合情况。9.统计学方法:采用GraphPad软件,qPCR的结果以`x±SEM表示。临床数据采用均数±标准差（`x±SD）的形式表示。统计学分析采用软件GraphPad自带的数据分析功能进行操作。应用非配对t检验进行两组定量资料的比较,应用单因素方差分析进行多组定量资料的比较。P<0.05表示差异有统计学意义。结果1.受试者的临床特征IGT受试者OGTT均符合糖耐量异常诊断标准:空腹静脉血糖（Fasting Plasma Glucose,FPG）<7.0mmol/L,负荷后2小时血糖（2 Hours Post Glucose-load,2hPG）≥7.8mmol/L<11.1mmol/L。共入组130人,其中正常对照组10人、安慰剂对照组60人、铬镁干预组60人。三组患者年龄匹配（P>0.05）。安慰剂对照组及铬镁干预组入组前血糖、糖化血红蛋白、血压等均无统计学差异（P均>0.05）。干预3个月后,铬镁干预组FBG、2hPG较干预前降低（P<0.05）。干预后,与安慰剂对照组相比,铬+镁干预组FBG、2hPG下降（P<0.05）,胰岛素抵抗较前改善。2.RNA质控分析所提取RNA OD260/280比值在1.56-1.97之间,OD260/230比值在1.81-2.06之间。质控分析RNA完整,片段分布几乎都在1500-4000 nt范围内,符合要求,可以进行后续的测序分析。3.miRNA的差异表达使用Illumina测序技术,在三组血浆样本中,得到了6个差异表达的循环mi RNA,分别为miR-182-5p、miR-96-5p、miR-27b、miR-21、mi R-379和miR-143。4.qPCR的结果为了验证Illumina测序的结果,我们对上述的6个差异表达的循环miRNA,miR-182-5p、miR-96-5p、miR-27b、miR-21、miR-379和mi R-143,在三组样本中进行了qPCR的验证。结果表明,仅有mi R-182-5p、miR-96-5p和miR-27b的表达趋势与NGS相同,验证了NGS的结果。与正常对照组相比,其中miR-182-5p的表达在安慰剂对照组显著降低（下降4.85倍,F=110.2,P<0.001）,而在铬（三价）和镁联合补充组,与安慰剂对照组相比,其表达有所上升（上升3.43倍,F=110.2,P<0.001）。miR-96-5p的表达在安慰剂对照组显著降低（下降4.82倍,F=110.2,P<0.001）,在铬（三价）和镁干预组,与安慰剂对照组相比,其表达有所上升（上升3.38倍,F=110.2,P<0.001）。miR-27b的表达在安慰剂对照组及铬镁干预组显著上升（上升3.34倍,F=102.7,P<0.001）;与安慰剂对照组相比,铬（三价）和镁干预组,其表达有所下降（下降2.42倍,F=102.7,P<0.001）5.miR-182-5p与miR-96-5p的靶基因预测通过三个数据库（TargetScan、Miranda和Microcosm）的预测分析,找到了miR-182-5p在这三个数据库里共同的靶基因大约有2000多个。其中541个基因由TargetScan和Miranda共同预测,302个基因由Miranda和Microcosm共同预测,26个基因由TargetScan和Microcosm共同预测。通过三个数据库（TargetScan、Miranda和Microcosm）的预测分析,找到了miR-96-5p在这三个数据库里共同的靶基因大约有1800多个。其中489个基因由TargetScan和Miranda共同预测,298个基因由Miranda和Microcosm共同预测,17个基因由TargetScan和Microcosm共同预测。通过比较miR-182-5p与miR-96-5p的靶基因预测结果,发现这两个miRNAs拥有一个共同的靶基因,NOX4。6.miR-182-5p与miR-96-5p的功能富集分析miR-182-5p靶基因的功能富集分析发现与214个GO条目有关,这214个条目可以分为54个与分子功能相关,67个与细胞组份相关,93个与生物学过程相关。信号通路分析表明,与之相关的信号通路是葡萄糖结合通路。miR-96-5p靶基因的功能富集分析发现与184个GO条目有关,这184个条目可以分为41个与分子功能相关,59个与细胞组份相关,84个与生物学过程相关。信号通路分析表明,与之相关的信号通路是磷脂酰肌醇信号通路。7.miR-182-5p与miR-96-5p的靶基因验证共转染miR-182-5p或者miR-96-5p的agomir与带有NOX4的报告基因系统的质粒,荧光素酶的荧光信号强度降低,共转染mi R-182-5p或者miR-96-5p的antiagomir与带有NOX4的报告基因系统的质粒后,荧光素酶的荧光信号强度增加。结论1.联合补充微量元素铬和镁可以改善IGT患者糖耐量,降低患者的FBG、2hPG。2.IGT患者miR-182-5p和miR-96-5p表达降低,补充铬镁后可使miR-182-5p和miR-96-5p表达升高。3.NOX4是miR-182-5p和miR-96-5p的共同靶基因。4.联合补充微量元素铬和镁通过增强miR-182-5p和mi R-96-5p表达,共同作用于靶基因NOX4而改善IGT患者的糖耐量。