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目的通过骨桥蛋白(OPN)对角膜成纤维细胞(CFs)与脐静脉内皮细胞(HUVECs)共培养模型作用的实验研究,来揭示OPN诱导角膜新生血管形成的相关因子及作用通路,为进一步研究微环境变化对OPN诱导角膜新生血管的机制奠定基础。方法1、遵从伦理学规定,基质透镜取材于刚刚完成屈光手术的患者。应用组织块法对飞秒激光角膜屈光手术获得角膜基质透镜进行培养,获得培养细胞。通过光镜观察、HE染色及免疫组织化学染色鉴定培养细胞为角膜成纤维细胞。应用Transwell培养小室系统建立CFs与HUVECs共培养模型。2、实验分为两大组：CFs与HUVECs共培养组、HUVECs单独培养组。两组培养24h后,分别加入PI3K/AKT抑制剂LY294002、ERK1/2抑制剂PD98059、骨桥蛋白抗体、抗整合素anti-αvβ3抗体,anti-VEGF抗体,30min后用骨桥蛋白诱导活化。孵育24h后,应用光镜观察内皮细胞增殖、迁移情况；应用ELISA、Real-timePCR、Western-blot观察VEGF mRNA及蛋白水平；应用Western-blot观察ERK1/2、PI3K/AKT磷酸化情况。结果1、培养飞秒激光角膜屈光手术中取出的角膜基质透镜。当培养至第5天,组织块周围出现放射状细胞爬出,第9天能够爬满培养瓶底。细胞呈长梭形,贴壁生长,多聚集在组织块周围,鱼群样,可以重叠生长。HE染色：细胞呈梭形或多角形,核仁明显,椭圆形,呈蓝色；细胞胞体较大,细胞质呈淡紫色。细胞免疫组织化学染色：Vimentin(+); Desmin (-)、S-100(-)、Keratin (-)。2、应用Transwell小室系统,将内皮细胞接种在上室,角膜成纤维细胞接种在下室,单独培养24h后将两者套叠在一起。成功建立CFs与HUVECs共培养模型。3、CFs与HUVECs共培养24h,将上室细胞用棉拭子擦去；以1%甲醛溶液固定下层细胞；0.5%结晶紫染色,发现共培养组下层细胞平均在121个,明显多于单独培养组。4、ELISA检验中,两实验组加入OPN后VEGF表达增高,共培养组高于单独培养组。加入抑制剂、抗体后各实验孔VEGF的浓度有下降(除anti-VEGF孔外,p均<0.05),OPN抗体、anti-αvβ3抗体孔VEGF下降最明显。共培养组中各孔均高于单独培养组,但差异不明显。荧光定量检测实验中,OPN诱导共培养组与单独培养组VEGF表达都明显升高,共培养组明显高于单独培养组。在共培养组与单独培养组,加入各种抗体VEGF表达都下降。与OPN对照,OPN抗体、PI3K/AKT抑制剂、ERK1/2抑制剂试验孔VEGF表达均明显下降,OPN抗体和anti-αvβ3抗体作用最明显。共培养在各药物组VEGF均值均高于单独培养组。5、Western blot实验中,OPN共培养组VEGF蛋白表达明显高于于单独培养组(p<0.05)。在共培养组与单独培养组,加入各种抗体VEGF表达均明显下降(p<0.05)。与OPN对照,OPN抗体试验孔下降最明显。同时发现OPN诱导共培养组和单独培养组ERK1/2、PI3K/AKT在0.5h有明显磷酸化,共培养组高于单独培养组(p<0.05)。OPN抗体与抗整合素anti-αvβ3抗体试验孔磷酸化均为检出。结论1.飞秒激光角膜屈光手术中取出的角膜基质透镜是角膜成纤维细胞培养的可靠组织来源。2.OPN通过CFs与HUVECs相互作用模型诱导内皮细胞迁移明显,单独诱导内皮细胞迁移不明显。3.CFs与HUVECs共培养模型在OPN能够诱导下VEGF的表达高于HUVECs单独培养组,CFs在VEGF表达中具有一定的作用,是潜在的抗新生血管的靶细胞。4、OPN通过ERK1/2、PI3K/AKT信号通路诱导CFs与HUVECs共培养模型VEGF表达,进而促进新生血管形成。