神经肽类激素是一类进化上古老的内源性活性物质,其主要受体类型G蛋白偶联受体（G protein coupled receptors,GPCRs）是细胞膜上最大的蛋白质超家族。它们介导的信号传导途径不仅广泛参与动物正常生长发育过程中的各种生命活动,而且还与多种疾病的发生、发展和治疗密切相关。因此,神经肽及GPCRs可作为重要的药物靶标,其相应的研究也一直位于医学新药研发、农业杀虫剂潜在靶标探索的前沿。由弥散神经内分泌系统分泌的甲状旁腺激素（parathyroid hormone,PTH）家族成员及其受体（parathyroid hormone receptors,PTHRs）在脊椎动物的钙和磷的调节、肾脏和骨骼的发育过程中发挥重要作用,人工合成的PTH也已在市面上获批用于骨质疏松症、甲状旁腺功能减退症等疾病的治疗。而在无脊椎动物中,对该信号系统的研究较少。本课题组和日本Tanaka课题组分别率先、相继在赤拟谷盗（Tribolium castaneum）、褐飞虱（Nilaparvata lugens）等代表性昆虫中发现了PTHRs的类似受体,命名为i PTHRs。然而,在昆虫等无脊椎动物中是否存在i PTHRs的内源性配体一直未见报道,i PTHRs仍以孤儿受体的形式存在。另外,本课题组早期对赤拟谷盗i PTHRs的功能研究发现,其干扰之后严重影响了昆虫蛹至成虫的蜕皮羽化过程及表皮形态建成,但具体作用机制尚不明确。基于以上背景,本研究主要以完全变态昆虫赤拟谷盗为实验材料,对其适应性进化机制进行分析,筛选鉴定其潜在的内源性配体并进行功能研究,同时利用组学测序对该信号系统的作用机制进行进一步的挖掘,另外,也在不完全变态昆虫褐飞虱中开展了对i PTHRs进行初步的结构和功能验证。通过上述实验,本研究试图为全面了解PTHRs/i PTHRs的进化、生理功能及作用机制提供新的线索,可望为害虫生物学防治中绿色杀虫剂的开发提供候选作用靶标,甚至为PTH信号系统影响人类钙磷代谢失调与骨质疏松、甲状旁腺功能减退症等疾病的发生和治疗提供参考。首先,本研究通过筛选更多类别无脊椎动物的i PTHR（含节肢动物蛛形纲、软体动物等类群）联合脊椎动物各纲代表性物种的PTHRs进行系统发生关系分析,并利用PAML（Phylogenetic Analysis by Maximum Likelihood）软件包中的Code ML程序对无脊椎动物的i PTHRs进行适应性进化分析,结果显示脊椎动物、无脊椎动物PTHRs/i PTHRs中发生了独立的复制和丢失事件,且无脊椎动物i PTHRs数目更多样化;无脊椎动物i PTHRs经历了选择压力,筛选出21个多位于胞外近膜端及跨膜结构域的正选择位点。由于正选择位点富集的部位为配体和受体结合的关键区域,暗示无脊椎动物中配体在序列上可能存在较大变异;其次,通过广泛搜集比对信息和利用Blast搜索筛选出昆虫i PTHRs的候选配体PXXXamide。赤拟谷盗的PXXXamide的蛋白质编码区域编码109个氨基酸,与脊椎动物PTH没有显著的序列同源性,但在节肢动物中比较保守;利用GPCR受配体鉴定系统对其与i PTHRs的关系进行鉴定,结果表明候选配体PXXXamide能显著激活i PTHRs表达细胞中钙离子关联的荧光信号,证明了PXXXamide的确是i PTHRs的内源性配体,命名为i PTH。利用实时荧光定量PCR和免疫组化对其进行时空表达分析,发现其在晚期蛹、中枢神经系统、肠呈现高表达,其中组织表达模式与受体i PTHRs一致。然而,利用RNA干扰技术对其进行功能分析,结果却表明i PTH干扰后对赤拟谷盗的生长发育没有影响,这与受体造成的畸形表型不一致;原因之一是可能在昆虫体内还存在另外的配体发挥作用,原因之二是结合免疫组化结果可知,干扰i PTH之后在中枢神经系统和肠组织中的大部分神经投射的阳性荧光信号已消失,但在一些神经肠内分泌细胞依旧保持着免疫阳性,可能这些仅存的i PTH即可保证机体的需要;再次,利用实时荧光定量PCR对该系统干扰后蜕皮激素合成与代谢、保幼激素合成与代谢及调控羽化相关基因的表达量进行检测,结果表明,i PTH信号系统在干扰之后,蜕皮激素合成通路中的关键酶基因CYP307A1、转录因子E74、Broad complex（Br-C）、FTZ-F1的表达量在i PTHRs干扰后均未发生改变;即使合成通路中的CYP315A1和CYP314A1表达量呈现轻微下调,并未造成干扰组3天蛹和5天蛹蜕皮激素含量的改变;保幼激素合成关键酶CYP15A1和JHAMT的表达量在i PTHRs干扰后显著上调;羽化相关神经肽CCAP、bursicon的受体CCAPRs、Rickets表达未受影响。这些结果表明了i PTHRs造成的蜕皮羽化失败并不是通过影响蜕皮激素合成与代谢、羽化相关调控基因造成的,而保幼激素的合成受到影响则可能是原因之一;另外,通过差异转录组学和相对定量蛋白质组学对i PTHRs干扰之后的下游调控网络进行分析,结果显示,在转录层面上,IB组与dsi PTHR1组、dsi PTHR2组分别鉴定出1231个、1683个差异表达基因,而dsi PTHR1组与dsi PTHR2组仅鉴定出14个差异表达基因。其中,i PTHRs在干扰后主要引起了能量与营养代谢（如异柠檬酸脱氢酶、ATP结合盒蛋白、果糖1,6-二磷酸酶）、表皮结构成分（几丁质合酶1、几丁质脱乙酰基酶、表皮蛋白若干家族成员）相关基因表达量改变,同时保幼激素代谢相关的保幼激素酯酶、保幼激素环氧水解酶表达量也明显上调;在蛋白层面上,IB组与dsi PTHR1组、dsi PTHR2组分别鉴定出34个、39个差异表达蛋白,而dsi PTHR1组与dsi PTHR2组鉴定出41个表达蛋白（主要由于dsi PTHR1组异常表达所致）。与转录组学测序一致的是,与对照组相比,干扰组的差异表达蛋白也集中在能量与营养代谢、表皮结构成分上,其中多个基因（如ATP合成酶亚基delta、肌钙蛋白亚基T、CPR18、CPAP1-H等）在转录、蛋白水平上均显示出下调趋势,表明了i PTHRs可能通过影响能量代谢影响赤拟谷盗的羽化行为,并造成表皮成分的合成异常;最后,通过对不完全变态昆虫褐飞虱i PTHRs的序列分析及RNA干扰功能验证,我们发现,其两个i PTHRs为物种内复制,序列相似性高达53.06%,这两个受体与赤拟谷盗i PTHR2更为接近,结合其它物种的i PTHRs多序列比对分析,表明i PTHR2可能是昆虫中的祖先基因;RNA干扰结果显示四龄若虫干扰i PTHR1和i PTHR2后部分个体蜕皮羽化失败,存活率分别降低至26.7%和55.5%,表明了i PTHRs在不完全变态昆虫褐飞虱的生长发育过程中也承担着至关重要的作用。