卵转铁蛋白抗菌肽的制备及纳米粒应用研究

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卵转铁蛋白(OVT)是含铁的蛋白成员之一,众所周知的就是它表现出的抗菌特性,这种特性主要表现为部分水解OVT衍生的肽,而这种肽的特殊性能有的没有被认知。为了开发OVT抗菌肽,本研究以OVT为酶解原料,抗菌活性为筛选条件,将酶解效果最佳的酶解产物,通过分离纯化技术得到具有抗菌活性的肽段,并对其抗菌机制深入研究。通过肽的作用机制设计了一种高效的靶向细菌细胞的载药纳米系统。然后通过体外实验和体内实验验证了纳米颗粒的抗菌活性,细胞摄取能力,体内靶向治疗能力以及生物安全性。主要研究结果如下:(1)采用两步乙醇提取法从鸡蛋蛋清中获得OVT,随后采用SDS-PAGE对OVT的纯度进行了分析。为获得最佳的具有抗菌活性的水解产物,对胃蛋白酶水解工艺条件进行研究,以抑菌率为指标,通过正交实验获得最佳水解条件。将获得的OVT水解产物首先通过3000 Da的超滤膜,然后采用离子交换色谱,G-15凝胶色谱柱和反相HPLC从OVT水解产物中成功分离出抗菌肽。最后,我们采用LC-MS/MS将其序列鉴定为AGLAPYKLKPIA(“OVTp12”)。OVTp12是一种新颖的十二肽,特别是它带有正电荷且为疏水性,而且空间结构预测和抗菌肽数据库APD的预测结果一致。通过抗菌活性实验,验证了该多肽具有较好的抗菌活性。(2)通过研究OVTp12对不同菌种的抗菌能力发现该多肽对多种菌有抑制效果,尤其是对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有很好的抗菌活性。OVTp12诱导的外/内细胞膜通透性结果表明,该多肽能够明显改变的大肠杆菌膜的通透性。此外,激光共聚焦和流式细胞实验研究表明,OVTp12能损伤膜的完整度,改变膜的渗透性,进一步揭示其抗菌机理。扫描电镜分析表明,OVTp12可引起大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的形态学改变。这些结果都表明,卵转铁蛋白多肽OVTp12可能是一种很有前途的食品保鲜或药物抗菌剂。(3)通过抗菌肽OVTp12与细菌细胞膜的相互作用能力,将其修饰在载药的介孔二氧化硅上,从而制备一种具有细菌细胞膜靶向性的新型纳米系统。首先,以共价缩合法制备了MSNs,然后通过交联剂EDC和NHS将多肽通过-COOH基团共价偶联到MSN-NH2上,将MSN或OVTp12@MSN与庆大霉素(Gen)混合,得到MSNs@Gen和MSNs@OVTp12@Gen。采用电镜技术对MSNs、MSNs@Gen和MSNs@OVTp12@Gen进行形貌和微观结构进行了观察,发现其颗粒平均直径逐渐增加,且EDS元素分布分析证明了负载Gen的MSNs被OVTp12成功修饰。此外,XRD,氮气吸附脱附和热重分析也都证明了OVTp12成功修饰在MSNs。在p H 6.5的磷酸缓冲溶液中研究了MSNs@Gen和MSNs@OVTp12@Gen的药物释放行为,发现其在8 h内表现出显著的释放。体外抗菌活性表明多肽修饰后的纳米颗粒展现出更好的抗菌活性,扫描电镜和激光共聚焦的表征也发现MSNs@OVTp12展现出与细菌细胞膜极好的相互作用能力。(4)通过制备OVTp12对大肠杆菌靶向的纳米系统,我们进一步研究其在体内的靶向给药能力。研究表面修饰多肽的纳米颗粒可以改变细胞的摄取能力,为胞内大肠杆菌感染的治疗提供了有希望的选择。值得注意的是,纳米颗粒有效的大肠杆菌靶向能力确保了抗生素在细菌感染部位的聚集,从而达到消除细菌的目的。同时,也将有效地避免滥用抗生素。此外,与游离药物相比,负载抗生素的纳米系统可以避免药物失活,治疗细菌感染,从而减轻体内炎症。同时,该纳米平台展示了高的载药能力和生物相容性好等特点,可应用于多种抗生素的释放,为细菌感染的治疗提供了一种新的思路。
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