研究背景和目的：乳腺癌是最常见的女性恶性肿瘤之一。全世界每年约有1000,000人患病,占女性新增恶性肿瘤的20%左右,400,000人死于乳腺癌。与西方发达国家相比,中国女性乳腺癌的发病率总体稍低,但随着经济和社会的飞速发展以及生活方式的西化,我国乳腺癌发病率在不断升高且发病年龄呈现年轻化的趋势。在一些发达城市,如上海、北京、天津、等地,乳腺癌年发病率已超过50/100,000,上海年发病率高达到52.98/100,000,年平均增长速度比欧美发达国家还高出1～2个百分点,跃居妇女恶性肿瘤发病率的第一位或第二位,对女性的身心健康构成严重威胁。按照当前的趋势,预计到2021年,我国女性乳腺癌的发病率将达到85.3/100,000,乳腺癌已成为我国肿瘤防治计划实施重点之一。乳腺癌是一种异质性肿瘤,其发生发展是遗传背景、体内激素水平、免疫状态、生理条件、生活习惯、环境等多因素、多步骤综合作用的结果。在相同的生活环境下,并不是所有女性都会发生乳腺癌,这与不同个体之间遗传背景的差异有关,即个体对乳腺癌的易感性不同。与肿瘤易感性密切相关的基因即为易感基因。在妇女中开展针对乳腺癌易感基因检测,建立适合中国女性的乳腺癌易感基因和多态性位点数据库,可以为乳腺癌高危人群的早期筛查以及个体化预防和治疗奠定基础。随着染色体连锁分析、候选基因突变筛查及关联分析等技术和方法的应用,许多与乳腺癌相关的遗传易感基因已得到逐步证实,这些基因大致分为三类：高外显率易感基因,如BRCA1、BRCA2、TP53、PTEN、STK11、CDH1等,这类基因在人群中的变异率相对较低但与乳腺癌患病风险高度相关,携带者的患病风险与普通人相比,乳腺癌的患病风险可提高5-10倍；中外显率易感基因,如ATM、CHEK2、PALB2、BRIP等,这类基因在人群中变异率中等,可使乳腺癌的患病风险提高2-4倍；低外显率易感基因,如FGFR2、ESR1、TOX3、LSP1、 MAP3K1、RAD51L1等,其在人群中的变异率较高,但患病风险度相对偏低,比值<1.5。目前,备受关注的全基因组关联研究(genome-wide association studies, GWAS)主要是针对众多低外显率易感基因上的大量单核苷酸多态性(Singlenucleotide polymorphism, SNP)位点进行的。SNP主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异形成的DNA序列多态性,在人群中的变异频率大于1%,包括碱基的转换、颠换、缺失和插入,但转换和颠换最为常见,是人类最常见的遗传变异形式,占所有已知多态性的90%以上。大量研究发现,SNP是疾病易感性、药物敏感性等生物性状(表型)差异的重要遗传学基础。基因组SNPs具有数量多、分布广、适于快速、大规模筛查等优点,决定了它更适合于遗传性和复杂性疾病的遗传检测以及基于群体的基因识别等方面的研究,从而成为继限制性酶切片断长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)和微卫星多态性(microsatellite polymorphism)之后的第三代遗传标志,也是易感基因引起肿瘤易感性的表现方式之一。因此SNP的相关研究将会为疾病的个体化诊断、预防和治疗提供重要数据基础和理论依据。除遗传背景外,体内雌激素水平是公认的乳腺癌危险因子。乳腺癌是一种雌激素依赖性肿瘤,其发生与体内雌激素水平升高或激素暴露时间的延长高度相关,许多其它乳腺癌危险因素也都是直接或间接通过雌激素产生作用。体内激素水平的高低取决于其合成与代谢的动态变化,雌激素的合成与代谢是由一系列生物酶催化完成的,包括与合成相关的碳链裂解酶(CYP11A1)、17α-羟化酶(CYP17)、芳香化酶(CYP19)、17β-羟基甾体脱氢酶(17β-HSD)、甾体硫酸酯酶(STS)以及与代谢相关的细胞色素P4501B1(CYP-1B1)、CYP1A1、CYP1A2.CYP3A4.儿茶酚-O-甲基转移酶(catechol-O-methyltransferase,COMT)等。而雌激素只有通过与其受体ER结合才能发挥生物学功能。因此,参与激素合成与代谢的生物酶以及雌激素受体的编码基因发生变异会影响其编码产物的活性和其功能,从而影响乳腺癌的发生和发展,而国内关于这方面的研究数据相对缺乏。DNA甲基化是最经典的表观遗传学调控方式之一,它是指DNA复制完成后,在DNA甲基转移酶(DNA Methyltransferase,DNMT)的催化作用下,将S-腺苷甲硫氨酸(SAM)上的甲基基团转移到DNA分子的胞嘧啶碱基或腺嘌呤碱基上的过程,但DNA的序列不发生变化。DNA甲基化在细胞增殖与分化、DNA与蛋白质相互作用、组织特异性基因表达、维持细胞正常功能等方面发挥重要作用。研究表明,DNA甲基化水平的异常会直接影响胚胎发育并诱发多种疾病甚至肿瘤的发生。哺乳动物中共有DNMTl.DNMT3A.DNMT3B.DNMT3L以及DNMT2五种甲基转移酶,其中起主要作用的是前三种。位于DNMTs基因上的单核苷酸多态性位点可能改变基因的转录进而影响其编码酶的表达和活性,从而参与乳腺癌的发生和发展。综上所述,雌激素合成、代谢相关基因和DNMTs多态性变化通过不同途径参与乳腺癌的发生和发展。已有研究表明,这两类基因的多态性变化与乳腺癌的患病风险相关,但大部分结果是以西方人群为基础,且不同地区的研究结论存在较大差异。本研究旨在通过病例-对照分析,探讨雌激素合成、代谢相关基因及DNMTs单核苷酸多态性与中国汉族女性乳腺癌易感性的相关性,从而为乳腺癌高危人群的筛查、早期诊断和个体化治疗提供理论依据和数据基础。研究方法：1.研究对象的收集根据病例对照研究设计,收集国内乳腺癌病例及同期的健康女性对照全血样本及相应临床信息,研究对象主要来源于广东、重庆、山东三个地区。2.SNP位点的挑选从NCBI的SNP信息数据库、全基因组关联分析以及其它国内外大样本研究得到的阳性位点中挑选出可能的乳腺癌易感SNP位点。所挑选的位点可分为两大部分：一部分位于雌激素合成代谢及雌激素受体相关基因上,另一部分位于DNA甲基转移酶基因上。3.基因分型与数据分析利用Sequenom MassARRAY(?)-IPLEX检测平台在中国汉族女性乳腺癌患者和健康对照者中进行基因多态性分型,整理检测结果并利用SPSS13.0软件进行相关统计分析。分别在共显性模型(Codominant model)、显性模型(Dominant model)、隐性模型(Recessive model)、超显性模型(Overdominant model)和附加模型(Log-additive model)五种遗传模型中探讨各个位点的多态性分布与乳腺癌患病风险的关系,筛选适合中国汉族女性的乳腺癌易感SNPs位点。4.对雌激素合成、代谢相关基因的SNPs位点,还根据乳腺癌患者癌组织ER和PR检测结果的不同,进行各位点多态性与激素受体ER和PR的相关性分析。探讨基因型分布与激素受体状态之间的相关性；对DNMTs基因上的SNP位点,按样本的来源不同,对各地区的乳腺癌易感SNPs位点分别进行统计分析,比较不同地区之间的差异性。结果：第一部分雌激素合成、代谢相关基因多态性与乳腺癌易感性本研究选取了位于雌激素合成、代谢相关基因及雌激素受体等17个基因上的38个SNPs位点,在530例广东汉族乳腺癌女性和546例健康对照女性中进行了基因分型和统计分析。结果显示,除rs2830、rs4680、rs707762、rs17268974和rs1695五个位点,其它33个位点的基因分布频率均符合Hardy-Weinberg平衡(e>0.05)且在所研究样本中存在多态性。病例对照分析共发现5个与乳腺癌发病风险相关的多态性位点,分别是1)rs2279357,符合共显性、隐性和附加遗传模型,与C/C及C/C-C/T基因型相比,T/T基因型携带者的患病风险升高,OR值(95%CI)分别为1.558(1.092-2.222),P=0.014和1.442(1.052-1.976),P=0.023,T为危险等位基因,OR值(95%CI)为1.234(1.037-1.469),P=0.018；2)rs2959003,符合共显性和附加遗传模型,与T/T基因型相比,携带C/C基因型可降低个体的患病风险,OR值(95%CI)为0.668(0.460-0.971),P=0.034。等位基因C为乳腺癌保护性等位基因,OR值(95%CI)为0.820(0.687-0.980),P=0.029；3)rs2959008,符合共显性、显性、附加遗传模型。与T/T基因型相比,携带C/C或C/T-C/C基因型可降低个体的患病风险,OR值(95%CI)分别为0.669(0.452-0.991),P=0.045和0.749(0.584-0.961),P=0.023。等位基因C为乳腺癌保护性等位基因,OR值(95%CI)为0.808(0.675-0.966),P=0.020;4)rs700519,符合共显性、显性、超显性、附加遗传模型。与C/C基因型相比,携带C/T或C/T-T/T基因型可降低个体的患病风险,OR值(95%CI)分别为0.723(0.541-0.965),P=0.028和0.731(0.552-0.968),P=0.029,与纯合型相比,杂合基因型C/T也与个体的患病风险相关,OR值(95%CI)为0.726(0.554-0.968),P=0.029。等位基因T为乳腺癌保护性等位基因,OR值(95%CI)为0.772(0.600-0.993),P=0.044；5)rs2069522,符合共显性、显性、超显性遗传模型,与T/T基因型相比,携带T/C或T/C-C/C基因型可使个体的患病风险升高,OR值(95%CI)分别为1.500(1.078-2.087),P=0.016和1.421(1.029-1.961),P=0.033,与纯合型相比,杂合基因型T/C也与个体的患病风险相关,OR值(95%CI)为1.510(1.085-2.101),P=0.015。对5个阳性位点的累积效应分析显示,个体携带危险基因型的个数与乳腺癌发病风险也有一定的关联性。与携带单个危险基因型相比,携带5个危险基因型的女性乳腺癌的患病风险显著增高OR值(95%CI)为2.286(1.187-4.399),P=0.013。基因多态性与激素受体表达状态的统计分析发现,有3个多态性位点的基因型分布与乳腺癌组织ER状态相关,其中rs2279357的T/T基因型和rs17268974的A/A基因型与乳腺癌组织ER(-)相关,OR值(95%CI)分别为0.574(0.366-0.899),P=0.015和0.468(0.243-0.900),P=0.023；而rs2446405的A/A基因型和等位基因A与乳腺癌组织ER(+)显著相关,OR值(95%CI)分别为2.072(1.147-3.742),P=0.016和1.341(1.030-1.746),P=0.030。有2个多态性位点的基因型分布与乳腺癌组织PR状态相关,其中rs2279357位点的T/T和等位基因T与乳腺癌组织PR(-)相关,OR值(95%CI)分别为0.529(0.312-0.898),P=0.018和0.741(0.571-0.963),P=0.025；rs130021位点的G/A基因型与乳腺癌组织PR(+)相关,OR值(95%CI)为1.756(1.164-2.648),P=0.007。第二部分DNMTs基因多态性与乳腺癌易感性本研究共选取了来自三个地区共1413例样本,其中乳腺癌病例组678例,健康对照735例。在这些样本中对DNMTs基因上的11个SNP位点进行了基因分型和相关统计分析。整体的病例对照分析结果显示,除两个位点(rs2228612和rs1 1254413)外,其余位点的分布频率均符合Hardy-Weinberg平衡(e>0.05)且在所研究样本中存在多态性。其中位点rs16999593在共显性、显性、超显性、附加遗传模型中有统计学意义。与T/T基因型相比,C/T和C/T-C/C均与乳腺癌患病风险相关,OR值(95%CI)分别为1.319(1.046-1.662),P=0.019和1.309(1.048-1.634),P=0.018,与纯合型T/T-C/C相比,基因型C/T也显示相同的结果,OR值(95%CI)为1.302(1.035-1.638),P=0.024。等位基因C也与乳腺癌患病风险明显相关,OR值(95%CI)为1.235(1.022-1.493),P--0.029。对不同地区来源的样本进行分层分析后发现,1)在广东女性中,rs2228612的基因型G/G和rs16999593的基因型C/T可增加乳腺癌的患病风险相关,OR值(95%CI)分别为1.713(1.057-2.775),P=0.029和1.775(1.235-2.553),P=0.002,而rs2424908的基因型C/T可降低乳腺癌的发病风险OR值(95%CI)为0.624(0.426-0.913),P=0.015；2)在重庆女性中,rs2114724的基因型T/C和-2228611的基因性A/G使乳腺癌的易感性升高,OR值(95%CI)为1.703(1.031-2.814),P=0.038,而rs2424908位点的基因型C/T使乳腺癌的易感性降低,OR值(95%CI)为0.585(0.346-0.989),P=0.045；3)在山东女性中,位点rs11887120的基因型C/T和rs11254413的基因型G/A均可降低乳腺癌的患病风险,OR值(95%CI)分别为0.553(0.360-0.851),P=0.007和0.072(0.040-0.132),P<0.001。结论：第一部分雌激素合成、代谢相关基因多态性与乳腺癌易感性1.本研究共筛选出5个与乳腺癌易感性相关的SNPs位点,分别为rs2279357、rs2959003、rs2959008、rs700519和rs2069522。它们均可不同程度的增加或降低乳腺癌的发病风险,且有一定的累积效应,与广东汉族女性乳腺癌的易感性显著相关。2.对乳腺癌病例组的分层分析发现,3个多态性位点rs2279357、rs17268974、rs2446405的基因型分布与乳腺癌组织ER表达状态相关,2个多态性位点rs2279357、rs130021的基因型分布与乳腺癌组织PR表达状态相关。3.位于基因CYP11A1上的多态性位点rs2279357,其T/T基因型既可增加乳腺癌的发病风险,且与乳腺癌组织ER(-)和PR(-)均显著相关,提示携带该位点变异的女性患乳腺癌的易感性升高并且对内分泌治疗药物不敏感,临床治疗效果和预后较差。第二部分DNMTs基因多态性与乳腺癌易感性1.各地区整体的统计分析结果显示,位于DNMT1基因的第4外显子区rs16999593位点的C/T基因型和等位基因C可使乳腺癌的易感性升高,携带者的发病风险是正常人群的1.319倍和1.235倍。这一结果与黑龙江省样本的研究结论恰恰相反。2.不同地区间的基因型分布以及与乳腺癌的易感性存在明显差异,其中rs2228612、rs16999593、rs2424908与广东地区女性的乳腺癌发病风险相关；rs2114724、rs2228611、rs2424908与重庆地区女性的乳腺癌发病风险相关；rs11887120、rs11254413与山东地区女性的乳腺癌发病风险相关。