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目的:探讨龙葵碱(solanine)能否诱导人胰腺癌SW1990细胞凋亡及诱导凋亡的可能机制。
方法:
1.用不同浓度的龙葵碱(5μg/ml,10μg/ml,15μg/ml和20μg/ml)处理体外培养的人胰腺癌SW1990细胞,通过倒置显微镜拍照观察龙葵碱作用后SW1990细胞的形态学改变。
2.用不同浓度的龙葵碱(5μg/ml,10μg/ml,15μg/ml和20μg/ml)处理体外培养的胰腺癌SW1990细胞,应用细胞活性技术方法(CellCountingAssayKit-8,CCK-8法)检测不同浓度龙葵碱处理不同时间(24h、48h、72h)对SW1990细胞体外生长的影响。
3.采用流式细胞术AnnexinV-FITC/PI双染法测定不同浓度的龙葵碱(5μg/ml,10μg/ml,15μg/ml和20μg/ml)处理24h后,对SW1990细胞早期凋亡及晚期凋亡率的影响。
4.采用细胞免疫荧光法检测15μg/ml龙葵碱处理SW1990细胞24h后,细胞内Smac/Diablo蛋白的分布情况。
5.应用蛋白免疫印迹法(WesternBlot)检测细胞凋亡调控基因p53和Bcl-2的蛋白表达以及线粒体凋亡蛋白cytc和Smac/Diablo表达的变化。
结果:
1.倒置显微镜下观察发现不同浓度龙葵碱(5μg/ml,10μg/ml,15μg/ml和20μg/ml)作用24h后可见细胞生长缓慢,随着给药浓度的增加可见人胰腺癌SW1990细胞变圆、皱缩、碎裂,贴壁细胞数逐渐减少,脱落细胞数逐渐增多,可见部分细胞悬浮。
2.不同浓度的龙葵碱(5μg/ml,10μg/ml,15μg/ml和20μg/ml)处理人胰腺癌SW1990细胞24h后,细胞生长抑制率分别为10.70±5.67%,30.46±12.25%,49.24±7.89%,67.11±4.98%;作用48h后细胞生长抑制率分别为22.92±3.10%,38.52±6.23%,56.31±6.83%,85.17±2.85%;作用72h后细胞生长抑制率分别为26.96±5.83%,52.00±7.37%,62.18±5.24%,89.87±2.72%。计算出在24h龙葵碱对SW1990细胞生长的IC50约为15μg/ml。
3.采用AnnexinV-FITC/PI双染法测定细胞凋亡率,结果显示对照组和不同浓度龙葵碱(5μ.g/ml,10μg/ml,15μg/ml和20μg/ml)处理SW1990细胞24h的早期凋亡率分别为0.51±0.22%,17.8±0.21%,25.78±0.94%,10.4±1.37%,1.94±0.11%;晚期凋亡率分别为1.38±0.33%,26.83±2.06%,28.22±1.4%,49.93±0.86%,73.25±1.35%。
4.细胞免疫荧光法显示药物组与对照组相比,大量的Smac/Diablo蛋白从线粒体转移到胞质中。
5.蛋白免疫印迹法(WesternBlot)检测结果显示p53蛋白表达量随着龙葵碱药物浓度(5μg/ml,10μg/ml,15μg/ml和20μ,g/ml)的增大呈增加趋势,Bcl-2蛋白表达量随着药物浓度的增大呈减少趋势,线粒体凋亡蛋白cytc和Smac/Diablo在胞质中的表达量均随着药物浓度的增大呈增加趋势。
结论:
1.龙葵碱具有诱导人胰腺癌SW1990细胞凋亡的作用,并具有时间和浓度依赖性。
2.龙葵碱诱导人胰腺癌SW1990细胞凋亡的机制可能与上调p53蛋白的表达和下调Bcl-2蛋白的表达以及促进线粒体释放cytc和Smac/Diablo有关。