百合内生真菌抑菌活性的研究

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植物内生真菌是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物各种组织和器官内部的真菌。内生真菌的次生代谢物在病虫害的生物防治、医药工业上的用途和范围逐渐增大,由于其物种丰富,数量庞大,而且与其他生物之间具有紧密的生态关系,使其成为活性物质的丰富来源,因而引起人们的广泛关注,成为目前研究的热点之一。近年来有很多研究表明,百合的提取物对细菌和真菌均有一定程度的抑制效果,由于植物内生真菌与寄主植物有复杂的关系,因此从百合中分离到具有抗菌活性的内生真菌的可能性非常大。本文分离百合球茎根组织中的内生真菌,筛选其中具有抗菌活性的菌株BH-3。以对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌圈直径作为响应值,采用单因素实验法对BH-3的培养条件和培养基组成进行优化,包括最适生长温度、培养基初始pH、接种量、装液量、基础培养基及其碳源、氮源。应用正交试验设计筛选培养基组成的关键因子,得到优化的培养基。以金黄色葡萄球菌为指示菌,对BH-3的发酵液进行不同的pH、高温、硫酸铵盐析、乙醇沉淀、环肽定性试验、超滤、紫外照射等处理,考察抗菌活性物质的特性;将发酵液用硫酸铵沉淀得到的蛋白粗提物,经过葡聚糖凝胶Sephadex-G100分子筛层析和DEAE葡聚糖凝胶A-50离子交换层析,进行了分离纯化,并对纯化后的样品进行SDS-PAGE电泳实验,主要结果如下:1.从健康百合组织中分离得到3株内生真菌,研究其发酵液对7种腐败菌生长的抑制作用,筛选到一株具有广谱抗菌活性的菌株BH-32.根据真菌内转录间隔区序列对其进行分子鉴定,确定其为尖孢镰刀属Fusarium oxysporum.3.在基础培养基的6个组分中,蛋白胨和磷酸二氢钾的浓度对BH-3发酵产物的抗菌活性具有显著的影响,分别具有负相关和正相关性。通过确定蛋白胨和磷酸二氢钾的最佳浓度,得到优化的培养基组成为葡萄糖15g/L,硫酸铵1g/L,蛋白胨6g/L,酵母膏1g/L,硫酸镁0.6g/L,磷酸二氢钾0.8g/L,VB10.03g/L。4.分离纯化得到一种具有良好抗菌活性的蛋白。将蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,测得其分子量大小为55KD。5.对该抗菌蛋白进行理化性质测定,发现其耐高温,对酸碱稳定。
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