论文部分内容阅读
背景梓葛冻干粉针为本实验室自主创制的抗脑缺血卒中的中药复方新药,由《千金方》中治疗中风著名方剂羌活汤主要成分梓醇和葛根素组成,其处方与制备工艺已经申报国家技术发明专利(公开号CN101574361A),制备工艺、质量标准和稳定性研究获得教育部基金(XDJK2009C084)资助,主要药效学研究获得重庆市科技攻关项目基金(CSTC,2010AC5011)资助,其对“脑血管神经单元”的保护作用研究获得西南大学研究生科技创新基金(Ky200901)资助。本课题组主要从缺血后神经功能恢复,脑梗死面积减少,血管新生、血管扩张,脑血流恢复,脑血管与神经细胞关系等方面进行研究。缺血性脑卒中是一个复杂的病理过程,涉及到自由基损伤、能量代谢障碍、炎症反应、细胞凋亡等方面。血管内皮细胞是缺血损伤中自由基和多种损伤性因子作用的重要靶点,血管内皮细胞受损活化是缺血损伤病理演变过程中的关键环节。中风作为严重危害人类健康的第三大致死疾病,迄今为止,临床上没有理想的办法恢复中风后丢失的神经功能。要重建受损的神经网络必须寻找新的替代“元件”,如新的神经细胞、新的血管、新的突触以及新的电兴奋连接。而干细胞因其良好的增殖和分化潜能,成为中风后细胞缺失替代良好的细胞来源。内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPCs)是源于骨髓的另一类成体干细胞,在治疗性血管再生中起了重要的作用。体外扩增EPCs再自体移植可能是治疗脑缺血的一个新颖有效的策略,研究梓葛冻干粉针对脑缺血大鼠内皮祖细胞和内皮细胞增殖的作用非常必要。目的(1)观察梓葛冻干粉针对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)正常及缺氧/复氧损伤环境下增殖的影响,并初步探讨其可能的损伤保护机制；(2)观察梓葛冻干粉针对大鼠骨髓来源内皮祖细胞(EPCs)正常及缺氧/复氧损伤环境下增殖的影响；(3)采用电凝法制备脑缺血大鼠模型,研究梓葛冻干粉针对脑缺血大鼠的神经功能保护作用,尤其是是否具有促进内皮祖细胞增殖的作用,为其新药创制提供依据。方法(1)体外培养HUVECs, MTT法观察梓葛冻干粉针对其增殖的影响：通过采用Krebs液建立缺氧/复氧损伤模型,用梓葛冻干粉针干预后,采用MTT法测定细胞活力、2,4-二硝基苯肼显色法测定细胞外乳酸脱氢酶(LDH)释放量、黄嘌呤氧化酶法测定细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活性、硫代巴比妥酸显色法测定丙二醛(MDA)含量、硝酸还原酶法测定一氧化氮(NO)含量；Western blot法考察细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的表达。(2)本课题采用密度梯度离心法和贴壁培养法相结合,使用专用培养基EGM-2,成功分离纯化EPCs,通过形态学,细胞表面分子标志物检测,内皮祖细胞吞噬功能对其进行鉴定：MTT比色法观察梓葛冻干粉针对其正常及缺氧／复氧损伤环境下增殖的影响及其保护作用。(3)采用电凝法[4]阻断大鼠大脑中动脉建立局部脑缺血模型,通过神经行为学Longa评分、平衡木评分,研究梓葛冻干粉针对脑缺血大鼠的神经功能保护作用。通过流式细胞仪检测梓葛冻干粉针对脑缺血大鼠外周血中EPCs增殖的实验研究。结果1.梓葛冻干粉针对HUVECs增殖及其缺氧/复氧损伤的离体实验研究正常培养条件下,梓葛冻干粉针12.25μg·mL-1、24.5μg·mL-1能够显著促进HUVECs的增殖(P<0.01)；缺氧/复氧损伤培养条件下,与模型组相比,梓葛冻干粉针12.5μg·mL-1显著提高HUVECs活力(P<0.05)；梓葛冻干粉针49.0μg·mL-1,24.5μg·mL-1,12.5μg·mL-1均显著提高缺氧/复氧后HUVECs SOD活性(P<0.05)；梓葛冻干粉针24.5μg·mL-1,12.5μg·mL-1能显著减少LDH的释放量及降低MDA和NO的含量(P<0.05),并上调HUVECs Bcl-2蛋白表达(P<0.05,P<0.01)；梓葛冻干粉针49.0μg·mL-1,24.5μg·mL-1,12.5μg·mL-1显著降低Bax的表达并上调Bcl-2/Bax (P<0.05, P<0.01),且梓葛冻干粉针49.0μg·mL-1，24.5μg·mL-1显著降低Caspase-3的表达(P<0.01)。2.梓葛冻干粉针对大鼠骨髓来源EPCs增殖的离体实验研究成功分离纯化EPCs,并对形态学鉴定,细胞表面分子标志物检测,内皮祖细胞吞噬功能等鉴定方法呈阳性。正常培养条件下,梓葛冻干粉针24.5μg·mL-1能够显著促进EPCs的增殖(P<0.05)；缺氧/复氧条件下,梓葛冻干粉针98.0μg·mL-1,49.0μg·mL-1能够显著促进EPCs的增殖(P<0.05,P<0.01)。3.梓葛冻干粉针对脑缺血大鼠神经功能及外周血中EPCs增殖的实验研究与假手术组相比,模型组与各药物组大鼠出现前肢卷曲、不平稳,前肢或后肢滑落等症状。与模型组相比,缺血第4、7天后,梓葛冻干粉针组神经行为学分值显著降低(P<0.05)；缺血第1、7天后,梓葛冻干粉针组平衡木行走分值均显著降低(P<0.05)；65.4mg·kg-1梓葛冻干粉针能够提高脑缺血大鼠外周血中EPCs的数量。结论1.梓葛冻干粉针能够显著促进正常及缺氧／复氧培养条件下HUVECs增殖,并可显著拮抗缺氧／复氧对HUVECs的损伤,可能与其抑制细胞过氧化损伤,增强细胞抗氧化和抗凋亡能力有关。2.成功分离纯化EPCs并对其进行了鉴定,梓葛冻干粉针对离体大鼠骨髓来源EPCs具有促进其增殖作用,并对缺氧／复氧损伤具有保护作用。3.梓葛冻干粉针对脑缺血大鼠的神经功能具有保护作用,并能促进缺血损伤时EPCs从骨髓动员到外周血中。