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目的:缺氧微环境是肝癌的常见特性之一,也是导致肝癌对化疗药物产生耐受的关键因素,因此针对缺氧肿瘤开发靶向抑制剂一直以来是抗肿瘤药物研发的热点。目前靶向缺氧肿瘤的小分子抑制剂,主要包括生物还原性前药和HIF-1α靶向抑制剂。这些药物难以在正常氧压下发挥抗肿瘤活性,导致整体抗肿瘤效果有限,研究进展缓慢。因此,亟需进一步开发新型的缺氧靶向抗肿瘤小分子实体化合物,不仅在缺氧下发挥更强效的抗肿瘤作用,并且在正常氧压条件下同样具有抗肿瘤活性,从而催生出新的缺氧抗肿瘤治疗方式,解决肝癌治疗的困境,改善治疗效果,延长患者的生存期。本课题前期获得一个新型FAK/IGF-1R/ALK多靶点抑制剂CT-707,目前已经通过CFDA批准,获得临床研究批件,处于I期临床研究阶段。前期数据发现缺氧下CT-707具有更强的抑制肝癌细胞增殖的作用。基于此,本文从体内外对CT-707缺氧抗肝癌活性进行研究,并探究参与该过程的关键分子及信号通路,以期为肝癌临床治疗提供潜在靶点和候选药物。方法:(1)SRB染色法检测小分子抑制剂对人肝癌细胞和人正常肝细胞的增殖抑制能力;(2)PI单染结合流式细胞术实验检测凋亡发生;(3)Western blot实验检测蛋白表达;(4)荧光定量PCR法检测mRNA水平;(5)免疫荧光实验检测蛋白在细胞内的分布情况;(6)质粒转染或siRNA技术过表达或沉默相关基因;(7)建立人源HepG2肝癌移植瘤裸小鼠模型,检测化合物对小鼠移植瘤的治疗作用。结果:1.CT-707对缺氧肝癌细胞具有更强的增殖抑制和凋亡诱导的作用我们通过SRB染色法检测,发现CT-707在缺氧下对肝癌细胞HepG2和Bel-7402具有更强的增殖抑制效果;采用PI单染结合流式细胞术实验,发现CT-707在缺氧下具有更强的诱导凋亡发生的能力;采用Western Blot检测凋亡蛋白,发现缺氧下CT-707作用后凋亡蛋白Cleaved-PARP明显增加。2.CT-707缺氧抗肝癌作用与缺氧诱导因子HIF-1α及其自身靶点FAK无关随后,我们探究了 CT-707缺氧抗肿瘤活性的机制。Western Blot和RT-PCR实验结果表明,CT-707在缺氧下不影响HIF-lα的蛋白水平及其下游靶基因表达水平。在正常氧压下通过CoC12累积HIF-1α或外源性过表达HIF-1α,或是在缺氧下通过siRNA沉默HIF-1α蛋白,均不能影响CT-707的抗肿瘤活性。随后,我们检测了常氧、缺氧下CT-707作用对p-FAK的影响,发现p-FAK在缺氧下并未发生激活,并且CT-707在常氧、缺氧下均能浓度依赖性地抑制p-FAK的表达。进一步实验发现,siRNA沉默FAK不能减小CT-707常氧、缺氧下抗肿瘤活性的差异。3.CT-707缺氧抗肝癌作用与其抑制IGF-1R通路的活性相关我们随后考察CT-707缺氧抗肝癌活性与另一靶点IGF-1R的相关性。Western Blot实验结果显示,CT-707在肝癌细胞上能抑制IGF-1和缺氧环境引起的p-IGF-1R的激活。随后在正常氧压下,通过IGF-1和Insulin诱导,模拟缺氧下IGF-1R激活,肝癌细胞对CT-707的敏感性增强,提示CT-707缺氧抗肝癌活性可能与IGF-1R靶点相关。4.CT-707通过干预IGF-1R诱导的YAP通路激活发挥缺氧抗肝癌活性Western blot实验结果表明,沉默IGF-1R会增加p-YAP的表达,而IGF-1和insulin作用增加p-IGF-1R后,会减少p-YAP的表达,提示IGF-1R能正性调控YAP。进一步,在缺氧环境下给予CT-707作用,发现CT-707能逆转缺氧引起的p-YAP的降低。免疫荧光、核质分离及RT-PCR实验结果显示,CT-707在缺氧下能抑制YAP入核,并降低YAP靶基因CTGF、Cyr-61、AREG的mRNA水平。随后,我们外源性转入YAP-5SA质粒,使得YAP维持在细胞核持续发挥活性,结果显示能明显减弱缺氧下CT-707的增殖抑制作用。5.CT-707对人肝癌HepG2裸小鼠移殖瘤具有显著抑制作用CT-707对人肝癌HepG2裸小鼠移殖瘤具有显著抑制作用,冰冻切片结合免疫荧光实验结果显示,CT-707在缺氧区域具有更强的诱导凋亡的作用。取瘤组织进行免疫荧光和RT-PCR实验,结果显示体内模型中CT-707能明显抑制YAP入核和对下游靶基因AREG、CTGF、Cyr-61的转录。结论:本课题研究发现,新型FAK/IGF-1R/ALK多靶点抑制剂CT-707在缺氧环境中具有更强的抗肝癌活性,表现为抑制肝癌细胞增殖和诱导肝癌细胞发生凋亡。有意思的是,CT-707缺氧抗肝癌活性的发挥既与HIF-1α无关,也不依赖对FAK的干预作用,而与CT-707靶向抑制缺氧激活的IGF-1R信号通路,干预YAP蛋白的核转位及下游靶基因激活有关。通过阻断缺氧激活的IGF-1R-YAP信号通路,CT-707在缺氧肿瘤微环境中发挥更强的体内外抗肝癌活性。我们的研究不仅为CT-707临床用于肝癌治疗提供了实验基础,也为靶向抑制IGF-1R-YAP信号通路作为缺氧肝癌的新型治疗策略提供了理论依据。