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背景与目的环状RNA（circular RNA,circRNA）是一种闭合呈环状特殊结构的非编码RNA。研究发现它具有多种生物学功能。作为ce RNA之一,它可吸附miRNA继而影响mRNA的转录;结合RBPs（RNA结合蛋白）参与转录表达或翻译。miRNA是一类长度约为22个核苷酸组成,广泛参与基因转录后调控的非编码小RNA。miRNA本身不具备编码功能,它主要通过与靶基因完全或不完全配对结合,从而发挥调控功能。mRNA作为信使RNA在肿瘤的发生发展中发挥着多重作用。RBPs可参与circRNA的形成,对circRNA的生物发生、定位、拼接和折叠、促进表达稳定中发挥作用。EMT是肿瘤细胞侵袭转移造成扩散的根源之一。在EMT（Epithelial-Mesenchymal Transition上皮间质转化）表型转化中,非编码RNA可以通过表观遗传学控制肿瘤相关基因的表达而影响肿瘤细胞增殖和转移生物学行为。本研究旨在发现并探讨肿瘤相关基因及其对胃癌病理生物学行为的影响。通过对胃癌发生和侵袭转移等机制的深入研究,为胃癌早期诊断及预后评估提供理论依据支持;为寻求个性化的精准治疗靶点提供理论基础。研究方法:1、常规培养人永生化正常胃粘膜上皮细胞系GES-1及人胃癌细胞系SGC-7901、BGC-823、AGS、HGC-27和MKN-45,手术切除的新鲜胃癌组织及配对远癌正常胃粘膜组织共130例均收集自中国医科大学附属第一医院胃肠肿瘤外科,提取total RNA后反转录cDNA,应用qRT-PCR法检测胃癌细胞和组织中hsa＿circ＿0005230的相对表达。分析胃癌组织中hsa＿circ＿0005230的表达与各临床病理因素间的关系。2、合成siRNA,在AGS和HGC-27胃癌细胞系中构建沉默hsa＿circ＿0005230表达的功能细胞系。采用CCK-8实验和平板克隆形成实验评估沉默hsa＿circ＿0005230对胃癌细胞的增殖能力影响;采用流式细胞术评估沉默hsa＿circ＿0005230对胃癌细胞的细胞周期变化的影响;采用划痕愈合实验及transwell迁移实验评估沉默hsa＿circ＿0005230对胃癌细胞迁移能力的影响;采用transwell侵袭实验评估沉默hsa＿circ＿0005230对胃癌细胞的侵袭能力的影响。采用Western Blotting检测沉默hsa＿circ＿0005230后胃癌细胞中EMT相关蛋白的表达变化。3、通过生信网站Circinteractome预测hsa＿circ＿0005230可海绵吸附miR-1299,应用qRT-PCR检测GES-1及五大胃癌细胞系和33例胃癌组织及其配对正常胃粘膜组织中miR-1299的表达情况,通过相关性分析明确hsa＿circ＿0005230与miR-1299在胃癌组织中的表达关系。利用Kaplan-Meier Plotter网站中胃癌数据库对miR-1299做生存分析。利用miRWalk和Target Scan网站对miR-1299结合的下游mRNA做预测。应用qRT-PCR检测GES-1及五大胃癌细胞系和51例胃癌及其配对正常胃粘膜组织RHOT1 mRNA表达量,分析胃癌组织RHOT1 mRNA表达水平与临床病理因素间的关系。基于hsa＿circ＿0005230、miR-1299和RHOT1 mRNA在胃癌组织中的表达水平分析三者之间的相关性;qRT-PCR检测沉默hsa＿circ＿0005230后miR-1299和RHOT1 mRNA表达水平的变化。利用双荧光素酶报告基因实验验证miR-1299与RHOT1之间是否有结合位点特异性结合。应用Western Blotting检测49例新鲜胃癌及其配对正常胃粘膜组织RHOT1蛋白表达水平;应用免疫组化染色法检测155例胃癌组织的RHOT1蛋白表达并分析其与临床病理因素之间的关系。4、通过Starbase网站预测与hsa＿circ＿0005230有潜在结合位点的RBP FUS。应用qRT-PCR检测GES-1及五大胃癌细胞系和32例人胃癌组织及其配对正常胃粘膜中FUS mRNA的表达水平。分析FUS mRNA与hsa＿circ＿0005230和RHOT1mRNA之间的表达相关性。分析胃癌组织中FUS mRNA表达水平与各临床病理因素间的关系。5、实验数据应用SPSS 22.0和Graph Pad Prism 8.0.2软件进行统计分析和作图。计量资料以mean士SD表示,两组间比较采用配对t检验;计数资料采用卡方检验,生存分析采用Kaplan-Meier分析并进行Log-rank检验,相关性分析采用spearman相关性检验,P<0.05时差异有统计学意义。结果:1、qRT-PCR法检测结果显示,与GES-1细胞系相比,hsa＿circ＿0005230在五大人胃癌细胞系中表达显著上调;与配对正常胃粘膜组织相比,hsa＿circ＿0005230在130例胃癌组织中表达上调（P=0.0477）。胃癌组织中hsa＿circ＿0005230表达水平与临床病理因素中胃癌的组织学分级（X2=4.186,P=0.014）、淋巴结转移（X2=7.754,P=0.021）和pTNM分期密切相关（X2=7.486,P=0.006）;其中在淋巴结转移因素亚组分析中,淋巴结转移数量较多亚组（N2-3）高表达率显著高于无淋巴结转移组（N0）（X2=4.873,P=0.027）。其他临床病理因素如性别、年龄、肿瘤大小、大体分型、WHO分型、Lauren分型、浸润深度、远处转移以及发病部位等与hsa＿circ＿0005230表达无关。2、本研究合成的siRNA片段可有效沉默hsa＿circ＿0005230。沉默hsa＿circ＿0005230后CCK-8实验结果显示胃癌细胞的增殖能力明显受到抑制;沉默hsa＿circ＿0005230后平板克隆形成实验结果显示胃癌细胞克隆形成能力明显减弱;沉默hsa＿circ＿0005230后流式细胞术实验显示胃癌细胞的细胞周期阻滞在G0/G1期。沉默hsa＿circ＿0005230后划痕愈合实验结果显示胃癌细胞迁移能力减弱,细胞划痕愈合率降低。Transwell迁移实验结果显示,沉默hsa＿circ＿0005230后胃癌细胞的迁移能力明显减弱。Transwell侵袭实验结果显示,沉默hsa＿circ＿0005230后胃癌细胞的侵袭能力明显减弱。沉默hsa＿circ＿0005230后Western blotting检测EMT通路主要蛋白的表达变化结果可见:与si-NC组相比,转染si-hsa-circ5230后上皮表型蛋白E-cadherin表达上调,同时间质表型的蛋白N-cadherin、Vimentin、Snail表达均下调。3、与正常胃粘膜上皮细胞GES-1相比,miR-1299在胃癌细胞系中表达显著下调;RHOT1 mRNA在胃癌细胞系中表达显著上调。与配对正常胃粘膜组织相比,miR-1299在33例胃癌组织中表达下调（P=0.0179）,RHOT1 mRNA在51例胃癌组织中表达上调（P=0.045）。胃癌细胞中沉默hsa＿circ＿0005230后miR-1299表达上调,RHOT1 mRNA表达下调。胃癌组织中hsa＿circ＿0005230与miR-1299表达呈负相关（P=0.0228,r=-0.4078）;miR-1299与RHOT1表达呈负相关（P=0.0237,r=-0.4053）;hsa＿circ＿0005230与RHOT1 mRNA表达呈正相关（P=0.0044,r=0.4971）;hsa＿circ＿0005230/miR1299/RHOT1轴分子之间在表达相关性上成立。双荧光素酶报告基因实验证实RHOT1与miR-1299之间有特异性结合位点。4、胃癌组织中RHOT1 mRNA表达水平与胃癌临床病理因素中淋巴结转移（X2=6.708,P=0.035）和pTNM分期（X2=8.209,P=0.042）相关,其中在淋巴结转移亚组分析中,与无淋巴结转移亚组（N0）相比,淋巴结转移数量较多组（N3）RHOT1 mRNA高表达率显著增加（X2=4.297,P=0.038）。胃癌其他临床病理因素如性别、年龄、大体分型、组织学分级、WHO分型、Lauren分型、浸润深度、远处转移以及发病部位等与RHOT1 mRNA表达水平无关。5、RHOT1蛋白定位于胞质,在胃癌组织中表达上调;与正常胃粘膜相比,RHOT1蛋白在胃癌组织表达阳性率显著升高（P<0.01）。对155例胃癌组织RHOT1蛋白表达与临床病理因素分析中发现:胃癌中RHOT1蛋白表达与组织学分级（X2=7.045,P=0.03）、Lauren分型（X2=8.861,P=0.012）、浸润深度（T）（X2=6.534,P=0.038）、淋巴结转移（N）（X2=5.929,P=0.015）和pTNM分期（X2=14.74,P<0.01）等临床病理因素相关。在Lauren分型亚组中,弥漫型胃癌组织RHOT1蛋白高表达较肠型的显著增多（X2=5.397,P=0.02）;混合型胃癌组织的RHOT1蛋白高表达与肠型的相比也显著增多（X2=8.607,P=0.003）;浸润深度（T）亚组分析中,浸润深度T4的RHOT1蛋白高表达率比浸润深度T3的显著增多（X2=4.958,P=0.026）。而其他病理因素如性别、年龄、肿瘤大小、大体分型、WHO分型、远处转移以及发病部位等与胃癌RHOT1蛋白表达无关。6、胃癌患者miR-1299的生存分析提示:按最佳cutoff值将胃癌患者分为miR-1299低表达组和高表达组,当突变负荷低时,miR-1299高表达的胃癌患者总生存时间（38.43个月）较低表达组（17.77个月）延长（P=0.014）,患者预后较好;而突变负荷高时两组表达无明显差异。在GEO数据库的GSE29272数据集中进行RHOT1 mRNA预后生存分析,纳入592例有效病理资料,依据表达中位值分为RHOT1 mRNA高表达组和低表达组,结果显示:RHOT1 mRNA低表达组总生存时间（28.7个月）较高表达组生存时间（20.6个月）明显增多,预后较好（P=0.0035）。7、预测FUS作为hsa＿circ＿0005230的RBP可能通过影响hsa＿circ＿0005230/miR-1299/RHOT1轴调控EMT通路影响胃癌的病理生物学行为。结论:1、Hsa＿circ＿0005230在胃癌细胞系和组织中表达上调,与组织学分级、淋巴结转移和pTNM分期相关,提示hsa＿circ＿0005230有望成为潜在的肿瘤标记物,为提高胃癌诊断水平,准确评估预后,为寻找个性化治疗靶点提供理论基础。2、沉默hsa＿circ＿0005230后可显著抑制胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力,逆转EMT表型变化,提示胃癌中差异表达的hsa＿circ＿0005230可影响胃癌细胞的恶性生物学行为。3、胃癌组织和细胞中RHOT1在mRNA及蛋白水平上均表达上调,与淋巴结转移和pTNM分期相关;胃癌细胞中上调表达的hsa＿circ＿0005230可调控miR-1299/RHOT1轴通过EMT表型通路影响胃癌的侵袭转移行为。这提示RHOT1和miR-1299有望成为胃癌患者治疗的新靶标,为有效控制胃癌提供精准治疗。4、FUS mRNA在胃癌组织和细胞中表达上调,且与淋巴结转移和pTNM分期临床病理因素相关,患者预后生存差。FUS作为RBP可能在上游作用于hsa＿circ＿0005230,进而影响其对胃癌的病理生物学行为。