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第一部分：BM-PCR方法富集突变型DNA的原理验证
【目的】我们设计了一种基于链迁移的选择性PCR(BM-PCR)方法，在该方法中我们引入了链迁移抑制链Blocker链(BM Blocker)以选择性地降低野生型基因的扩增效率，从而富集突变型基因。
【方法】在PCR过程中引入链迁移抑制链BMBlocker。我们设计BMBlocker与野生型DNA(wild-type, WT)序列完全匹配，而与突变型DNA(mutant-type, MT)有一个碱基错配。当引物和Blocker链与WT结合时，它们会经历链迁移过程，WT在PCR扩增过程中的扩增概率为1/(1+n)，其中n是BMBlocker链和引物的重叠区，而MT在PCR扩增中的扩增概率约为1，因为BMBlocker与MT有一个碱基的错配，因而不能与MT紧密结合。因此，MT可以通过PCR进行富集。
【结果】我们的实验结果表明引物和BMBlocker之间的链迁移过程对聚合酶的延伸率有负面影响。高分辨熔解曲线分析(high resolution melting curve analysis, HRM)结果进一步表明BM-PCR可明显提高突变丰度。
【结论】我们的实验数据证实了BM-PCR能够在扩增过程中富集低丰度点突变。
第二部分：BM-PCR方法联合DNA探针法用于人子宫内膜癌突变基因的检测
【目的】低丰度点突变的富集对于生物分析和分子学诊断至关重要。我们在BM-PCR方法的基础上引入荧光DNA探针用于富集低丰度突变。
【方法】我们设计并合成了一条荧光DNA探针链，其序列与突变型DNA完全匹配，因此其与野生链有一个碱基的错配。另外，我们设计探针与BMBlocker链之间有部分碱基的重叠。对于BMPCR，考虑到聚合酶延伸的间隙，我们设计引物与BMBlocker之间重叠4个碱基，剩下9个碱基区域用于Blocker链与探针重叠。这样，探针将与BMBlocker链竞争性的与底物链相结合，从而进一步提高本方法对MT和WT的识别能力，并将富集步骤和随后的分析步骤合并为一个步骤。实际上，BMBlocker链具有两种功能：与引物竞争以丰富突变型DNA的丰度；与探针竞争以提高对突变位点的识别能力。总的来说，三种成分的结合使低丰度点突变的检测变得快速而灵敏。
【结果】Sanger测序表明，BM-PCR可以将突变丰度从5％提高到约50％。荧光DNA探针可以在BM-PCR过程中与MT偶联，以进一步提高本方法的特异性，并将检测限降低到0.1％。我们对癌症患者的血细胞和子宫内膜癌组织样本中的基因组DNA进行了BM-PCR扩增，结果证明了BM-PCR在实际临床样本中的实用性。
【结论】总体而言，与其他富集突变方法相比，BM-PCR易于设计，且操作简便。研究人员只需要优化Blocker链的温度，整个检测过程仅仅是PCR扩增。我们期望我们建立的BM-PCR方法将在分子诊断和临床分析中被广泛应用。
第三部分：BM-PCR方法联合内切酶IV信号放大系统用于人子宫内膜癌突变基因的检测
【目的】血液和组织中低丰度点突变的检测方法的不断创新正在成为未来检测癌症和其他与基因突变相关疾病的新方向。我们开发出一种新的简单的方法来检测癌症患者组织样本中的低丰度点突变。
【方法】基于上述BM-PCR方法，我们认为在BM-PCR方法基础上结合内切酶IV信号放大系统将进一步提高突变基因检测的灵敏度。对于内切酶IV信号放大系统，我们设计并合成了一条含有一个空位碱基的荧光DNA探针序列。该探针的5’端标FAM发光基团，3’端标BHQ1荧光猝灭基团。设计探针序列与突变DNA链互补，而与野生型DNA链有一个碱基的错配。另外我们在内切酶IV信号放大系统中引入了一条与探针竞争的竞争链即s-Blocker。设计s-Blocker的序列与野生型DNA互补，因此其与突变型DNA有一个碱基的错配。这样，竞争性s-Blocker将和探针竞争性的与底物DNA链结合，其中一条链将在一定的解链温度下从底物DNA链上解离。重要的是，我们设计的探针与竞争链s-Blocker链具有相同的DNA序列。因此，s-Blocker/野生型DNA双链复合物和探针/突变型DNA双链复合物的熔解温度几乎相同。总体而言，MT的信号被放大，因此检测极限将进一步降低。
【结果】Sanger测序结果表明，BM-PCR方法可以将突变丰度从5%提高到40%，具有较高的富集效率。此外，内切酶IV信号放大系统的引入将进一步降低本方法的检测限。BM-PCR方法联合内切酶IV信号放大系统检测子宫内膜癌患者癌组织中的PTENr130q(389g>a)和PTENrs121909219突变，结果表明该两种突变的检测限分别为0.02%和0.01%。
【结论】我们建立了BM-PCR与内切酶IV信号放大系统相结合的方法用于检测低丰度点突变。据我们所知，我们的方法对于检测临床实际组织中基因组DNA低丰度突变具有较高的灵敏度。我们期望该方法可以为子宫内膜癌基因突变的分析以及子宫内膜癌的诊断提供参考。
【目的】我们设计了一种基于链迁移的选择性PCR(BM-PCR)方法，在该方法中我们引入了链迁移抑制链Blocker链(BM Blocker)以选择性地降低野生型基因的扩增效率，从而富集突变型基因。
【方法】在PCR过程中引入链迁移抑制链BMBlocker。我们设计BMBlocker与野生型DNA(wild-type, WT)序列完全匹配，而与突变型DNA(mutant-type, MT)有一个碱基错配。当引物和Blocker链与WT结合时，它们会经历链迁移过程，WT在PCR扩增过程中的扩增概率为1/(1+n)，其中n是BMBlocker链和引物的重叠区，而MT在PCR扩增中的扩增概率约为1，因为BMBlocker与MT有一个碱基的错配，因而不能与MT紧密结合。因此，MT可以通过PCR进行富集。
【结果】我们的实验结果表明引物和BMBlocker之间的链迁移过程对聚合酶的延伸率有负面影响。高分辨熔解曲线分析(high resolution melting curve analysis, HRM)结果进一步表明BM-PCR可明显提高突变丰度。
【结论】我们的实验数据证实了BM-PCR能够在扩增过程中富集低丰度点突变。
第二部分：BM-PCR方法联合DNA探针法用于人子宫内膜癌突变基因的检测
【目的】低丰度点突变的富集对于生物分析和分子学诊断至关重要。我们在BM-PCR方法的基础上引入荧光DNA探针用于富集低丰度突变。
【方法】我们设计并合成了一条荧光DNA探针链，其序列与突变型DNA完全匹配，因此其与野生链有一个碱基的错配。另外，我们设计探针与BMBlocker链之间有部分碱基的重叠。对于BMPCR，考虑到聚合酶延伸的间隙，我们设计引物与BMBlocker之间重叠4个碱基，剩下9个碱基区域用于Blocker链与探针重叠。这样，探针将与BMBlocker链竞争性的与底物链相结合，从而进一步提高本方法对MT和WT的识别能力，并将富集步骤和随后的分析步骤合并为一个步骤。实际上，BMBlocker链具有两种功能：与引物竞争以丰富突变型DNA的丰度；与探针竞争以提高对突变位点的识别能力。总的来说，三种成分的结合使低丰度点突变的检测变得快速而灵敏。
【结果】Sanger测序表明，BM-PCR可以将突变丰度从5％提高到约50％。荧光DNA探针可以在BM-PCR过程中与MT偶联，以进一步提高本方法的特异性，并将检测限降低到0.1％。我们对癌症患者的血细胞和子宫内膜癌组织样本中的基因组DNA进行了BM-PCR扩增，结果证明了BM-PCR在实际临床样本中的实用性。
【结论】总体而言，与其他富集突变方法相比，BM-PCR易于设计，且操作简便。研究人员只需要优化Blocker链的温度，整个检测过程仅仅是PCR扩增。我们期望我们建立的BM-PCR方法将在分子诊断和临床分析中被广泛应用。
第三部分：BM-PCR方法联合内切酶IV信号放大系统用于人子宫内膜癌突变基因的检测
【目的】血液和组织中低丰度点突变的检测方法的不断创新正在成为未来检测癌症和其他与基因突变相关疾病的新方向。我们开发出一种新的简单的方法来检测癌症患者组织样本中的低丰度点突变。
【方法】基于上述BM-PCR方法，我们认为在BM-PCR方法基础上结合内切酶IV信号放大系统将进一步提高突变基因检测的灵敏度。对于内切酶IV信号放大系统，我们设计并合成了一条含有一个空位碱基的荧光DNA探针序列。该探针的5’端标FAM发光基团，3’端标BHQ1荧光猝灭基团。设计探针序列与突变DNA链互补，而与野生型DNA链有一个碱基的错配。另外我们在内切酶IV信号放大系统中引入了一条与探针竞争的竞争链即s-Blocker。设计s-Blocker的序列与野生型DNA互补，因此其与突变型DNA有一个碱基的错配。这样，竞争性s-Blocker将和探针竞争性的与底物DNA链结合，其中一条链将在一定的解链温度下从底物DNA链上解离。重要的是，我们设计的探针与竞争链s-Blocker链具有相同的DNA序列。因此，s-Blocker/野生型DNA双链复合物和探针/突变型DNA双链复合物的熔解温度几乎相同。总体而言，MT的信号被放大，因此检测极限将进一步降低。
【结果】Sanger测序结果表明，BM-PCR方法可以将突变丰度从5%提高到40%，具有较高的富集效率。此外，内切酶IV信号放大系统的引入将进一步降低本方法的检测限。BM-PCR方法联合内切酶IV信号放大系统检测子宫内膜癌患者癌组织中的PTENr130q(389g>a)和PTENrs121909219突变，结果表明该两种突变的检测限分别为0.02%和0.01%。
【结论】我们建立了BM-PCR与内切酶IV信号放大系统相结合的方法用于检测低丰度点突变。据我们所知，我们的方法对于检测临床实际组织中基因组DNA低丰度突变具有较高的灵敏度。我们期望该方法可以为子宫内膜癌基因突变的分析以及子宫内膜癌的诊断提供参考。