血红素蛋白是一类重要的金属蛋白,在生命中执行不同的生物学功能。研究蛋白质与DNA之间相互作用,有助于从分子水平探索蛋白质结构和人工核酸酶功能之间的关系,具有一定的生物意义和潜在的应用价值。本文以肌红蛋白(Mb)为典型蛋白,进行血红素中心设计,调控其DNA酶学活性,主要包括以下内容:第一章:简单介绍了肌红蛋白的结构和功能,及血红素蛋白的结构与功能研究,并初步介绍血红素蛋白与DNA相互作用的研究进展。第二章:我们发现,在还原剂二硫苏糖醇存在时,氧载体肌红蛋白具有断裂双链DNA活性。在血红素活性中心引入远端组氨酸,His29和His43,可调控Mb氧化断裂DNA活性。机理实验证明,单线态氧和羟基自由基是高效断裂DNA的活性氧物种。紫外光谱和EPR光谱实验说明,His43具有促进Mb氧化断裂能力,His29具有抑制Mb氧化断裂能力。研究结果表明,肌红蛋白血红素活性中心的微环境,即血红素远端氢键网络,可调控蛋白的结构和生物酶活性。第三章:我们在远端29位引入谷氨酸构建了单突变体蛋白L29E Mb,在不加入还原剂下可催化双链DNA断裂。机理实验和T4连接实验证明,L29E Mb通过水解机制将双链DNA断裂成线状和开环缺刻状态。因此,这一突变体蛋白是首次被发现具有类似于天然限制性内切酶活性的血红素蛋白。这些研究为血红素蛋白断裂DNA提供了重要信息,为基于血红素蛋白分子骨架理性设计人工核酸内切酶奠定基础。第四章:我们用原卟啉锌(ZnPP)取代肌红蛋白血红素辅基后,构建了重组蛋白ZnPP-Mb,在420-430 nm波长光的激发下具有断裂DNA活性。紫外可见光谱证实,ZnPP能完全组装至脱辅基肌红蛋白(apo-myoglobin,apo-Mb)疏水空腔中。凝胶电泳实验进一步显示,仅在420-430 nm波长光照射下,可以激发蛋白断裂DNA,断裂过程中单线态氧、羟基自由基和超氧阴离子均有可能参与反应。通过与配合物ZnPP对比试验,结果显示,重组蛋白ZnPP-Mb在低浓度时经光引发即可断裂DNA。通过研究重组蛋白的核酸酶活性,发现His29具有抑制光致断裂活性作用。本研究所制备的光敏蛋白为蛋白质分子设计和药物分子设计提供指导意义,同时拓宽了蛋白质在药物化学上的应用前景。