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结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)是引起人和动物结核病的病原,巨噬细胞是其主要宿主细胞;有研究报道巨噬细胞可通过自噬作用清除胞内的Mtb,而Mtb却有相应的机制逃避巨噬细胞的自噬清除作用。MAPK信号转导通路等多条途径参与自噬调节,双特异性磷酸酶(dual specificity protein phosphatases,DUSPs)蛋白家族是MAPKs蛋白的内生性抑制因子,在调控MAPK信号转导中有着重要的作用。DUSP5是DUSPs蛋白家族成员之一,它在多种细胞的自噬调控作用已有报道,但它是否也参与调节Mtb感染所诱导的自噬却未有相关研究报道。为探究DUSP5在BCG感染诱导巨噬细胞自噬中的调控作用及其作用机制,本研究用慢病毒转染的方法建立DUSP5过表达/干扰RAW264.7稳定转染细胞株;并用雷帕霉素(Rapamycin,Rapa)和巴弗洛霉素A1(Bafilomyc]inAl,BafAl)分别刺激稳定转染细胞株初步探究DUSP5对巨噬细胞自噬的调控;进而采用BCG和ERK1/2抑制剂PD98059刺激DUSP5过表达/干扰RAW264.7稳定转染细胞株以探究DUSP5在BCG诱导巨噬细胞自噬的调控作用及其机制。实验结果如下:1.用慢病毒转染的方法成功获得了 DUSP5过表达及干扰的RAW264.7稳定转染细胞株,为后续探究DUSP5在巨噬细胞自噬中的调控作提供了良好的实验材料。2.雷帕霉素刺激后,DUSP5过表达的RAW264.7稳定转染细胞株中自噬相关蛋白LC3II表达量显著下调,而DUSP5干扰的RAW264.7稳定转染细胞株中自噬相关蛋白LC3II表达量显著上调,说明DUSP5抑制LC3II蛋白表达。3.用巴弗洛霉素A1刺激DUSP5干扰的RAW264.7稳定转染细胞株,LC3II表达量升高且自噬体数量增多。说明DUSP5可能通过抑制自噬体形成参与调控巨噬细胞RAW264.7自噬。4.BCG刺激后,DUSP5过表达RAW264.7稳定转染细胞株中自噬相关蛋白Beclin1、Atg5、Atg7和LC3II表达量显著降低且胞内自噬体数量减少;DUSP5干扰RAW264.7稳定转染细胞株中自噬相关蛋白Beclin1、Atg5、Atg7和LC3II表达量升高显著,自噬体数量增多。说明DUSP5抑制BCG感染巨噬细胞RAW264.7自噬相关蛋白的表达,其可能在BCG感染诱导巨噬细胞RAW264.7自噬中发挥负调控作用。5.BCG刺激后p-ERK表达量上调,然而过表达DUSP5,巨噬细胞RAW264.7中p-ERK1/2表达量显著下调,抑制DUSP5表达,巨噬细胞RAW264.7中p-ERK1/2表达量上调,而total-ERK1/2的表达量均无明显变化,说明BCG可诱导巨噬细胞ERK1/2信号途径活化,而DUSP5却抑制了 ERK1/2磷酸化。6.用PD98059抑制BCG刺激细胞中ERK1/2信号传导,DUSP5过表达和干扰RAW264.7稳定转染细胞株中自噬相关蛋白Beclin1的表达量均下调显著,而LC3II没有显著变化,说明自噬相关蛋白Beclin1的表达受到ERK1/2途径的调控。综上所述,在结核分枝杆菌诱导巨噬细胞自噬的过程中,DUSP5参与此过程的调节。DUSP5通过抑制ERK1/2磷酸化调控ERK1/2信号转导通路活化所引起的蛋白表达,其中在自噬相关蛋白的表达调控中,此过程主要介导自噬相关蛋白Beclin1的表达。Beclin1是自噬的起始蛋白,它参与了自噬体膜的形成。由此推测,DUSP5参与调控BCG诱导巨噬细胞RAW264.7自噬可能是通过抑制ERK1/2信号传导通路,抑制Beclin1表达,致使自噬体膜形成受阻,进而在自噬中发挥负调控作用。