微孢子虫是一种专营细胞内寄生的单细胞生物,能感染从原生动物到哺乳动物,包括昆虫、鱼类和人类在内的几乎所有的动物。微孢子虫可以通过其腐烂的昆虫和排泄物经由环境水平传播感染其他个体或种群。柞蚕微孢子虫是引起柞蚕微粒子病的病原,给柞蚕业生产带来极大的危害。目前对该物种的细胞分子水平上的研究还比较薄弱,对该物种的染色体核型的相关研究更是处于空白。据此我们研究鉴定了柞蚕微孢子虫超微结构和染色体组型,并进行了全基因组DNA的测序和比较基因组学分析。实验选取经Percoll纯化后的单丝腺来源的柞蚕微孢子虫为材料,光学显微镜观察显示柞蚕微孢子虫的形态为椭圆形,大小为3-5μm,具有典型的微孢子虫形态。采用DAPI和SYBR Green Ⅰ两种染料进行微孢子虫的细胞核染色,于荧光显微镜下观察细胞核的形态和数目,结果显示SYBR Green Ⅰ(1μL/ml)的染色后的荧光激活成相中,可清晰观察到双核结构。进一步将孢子超薄切片后用透射电子显微镜观测柞蚕微孢子虫的内部基本超微结构,结果显示柞蚕微孢子虫的内部结构包括:AD(锚定层);LP(极膜层);SP(孢原质);EX(孢子外壁);EN(孢子内壁);N(细胞核);PT(极管);RER(粗面内质网);PV(后极泡)。柞蚕微孢子虫内部结构与Nosema属的已报道的微孢子虫一致,暂未发现组织特异性结构。孢子内有盘绕的管状结构的极丝,极丝一端与后极泡连接,另一端固定在孢子前端的锚体中,前部呈棒状,后部卷曲呈螺旋状,盘绕在孢子后极内侧。孢原质内含有双核结构的细胞核。采用流式细胞(FCM)技术对柞蚕微孢子虫全基因组DNA大小进行初步估计,以已知基因组DNA大小的家蚕微孢子虫为实验参照,通过SYBR Green Ⅰ染色分别标记浓度约为2×108个/mL柞蚕微孢子虫和家蚕微孢子虫DNA后,通过FCM检测每个独立孢子虫的荧光强度,进而确定单细胞核DNA含量,结果显示柞蚕微孢子虫的基因组大小比家蚕微孢子虫要小。进一步将经percoll纯化后的109个/mL的柞蚕微孢子材料用低熔点琼脂糖制备plug后,采用了脉冲电泳技术进行柞蚕微孢子虫染色体的分离和大小估计,结果显示,脉冲电泳采用箝位匀强电泳(CHEF)分别以时间3h-20h在60s-90s的范围内进行梯度切换分离全基因组DNA,获得了重复性强并且较清晰地染色体条带13条,同时通过与大片段的酵母marker的参照比较,估计了各独立分离的染色体大小,总的基因组大小约为9.32M。将纯化的柞蚕微孢子虫提取全基因组DNA后由华大基因进行测序,获得了4,237,990条Reads数据,有效深度30倍。SOAPdenovo组装软件对reads数据进行组装,利用reads的匹配信息,对软件组装结果进行补洞、单碱基校对,所得的全基因组框架图数据,经生物信息技术预测共得到3413个基因,将这些基因与其他种的微孢子虫基因进行基因长度比较和转录起始位点保守基序分析。可以看出,柞蚕微孢子虫基因长度相对家蚕微孢子虫要长,但基因间区要短,预示着不同微孢子虫基因组组成受到的束缚压力不同。对柞蚕微孢子虫全基因组基因数据进行功能代谢途径的分析,结果显示,各分类的基因所占比例基本接近,但也存在一定差异,DNA复制重组与修复相关基因占最大比例,这可能与数据库本身的数据多少以及种类差异有关。讨论了与能量代谢有关的基因及相互关系,发现在柞蚕微孢子虫中碳水化合物代谢合成ATP/NADPH,进而提供能量的相关途径中,糖酵解途径中生成丙酮酸的酶类中缺少E1酶复合体;缺少三羧酸循环(TCA)循环的核心酶类,很可能是依赖宿主或通过其他未知途径获得能量。磷酸戊糖途径缺少下游降解葡萄糖三磷酸(G-3-P)和葡萄糖七磷酸(G-7-P)的酶,可能存在参与氧化磷酸化的脱氢酶和复合体V相似序列。此外发现了Nosema atheraeae中存在海藻糖途径完整,具有海藻糖酶前体基因和将海藻糖六磷酸(Tre-6-P)催化到葡萄糖六磷酸(G-6-P)的代谢酶类,表明Nosema antheraeae可能利用海藻糖代谢途径进行产能。