我国是水稻生产大国,米糠产量极为丰富。米糠中含有丰富的生物活性物质,是一个巨大的资源宝库。近年来的研究表明:米糠多糖(rice bran polysaccharide,RBP)具有抗肥胖、降脂、抗心脑血管疾病、降血糖、抗癌和提高免疫力等多种生理功能。但由于其利用的研究不足,米糠至今大部分仅被用作饲料,并未进行深层加工,造成了米糠这一宝贵资源的极大浪费。而且米糠多糖降血脂的研究也处于起步阶段,还没有涉及其分子机理。本课题采用超声波辅助提取的方法提取米糠多糖,并对米糠多糖进行了检测,然后以高脂血症小鼠和HepG2细胞为模型,评估米糠多糖对高脂血症的降低功效,在此基础上,探讨米糠多糖降脂的分子机理,为进一步深入研究米糠多糖和开发米糠多糖功能性食品、保健品提供科学的理论依据。1.米糠多糖提取与检测米糠去除杂质粉碎后加入热水中超声,离心后取上清液后加入淀粉酶和蛋白酶,再次离心取上清液,再加乙醇旋转蒸发浓缩干燥得到米糠多糖。检测后发现该米糠多糖为水溶性膳食纤维,有糖类物质存在但无还原糖、淀粉、氨基酸、蛋白质和糖醛酸存在。通过测定得知提取的米糠多糖中的多糖含量为81.40%,提取率为1.66%。分子量测定得知该米糠多糖主要包含两个主要不同分子量的峰,一个峰的分子量大约在500 000 Da,约占85%,另一个主要峰的分子量大约在25 000 Da,约占比15%。另外测得该米糠多糖中主要含有甘露糖、葡萄糖、木糖和阿拉伯糖四种单糖,且摩尔比为:1.35:3.32:1:1.25,不含有半乳糖、鼠李糖和岩藻糖。最后红外光谱测定该提取米糠多糖的吸收光谱图,吸收峰表明样品中有α-糖苷键存在且分子构成为杂单糖,不含糖醛酸。2.米糠多糖对高脂血症小鼠降脂功效及分子机理研究本实验利用高脂饮食(high fat diet,HFD)建立高脂血症动物模型,探讨米糠多糖的抗高脂血症功效及其可能的分子机理。将60只雄性ICR小鼠随机分为对照组,HFD组和HFD+RBP组,每组20只。对照组给予标准饮食,另外两组给予高脂饮食。另外,HFD+RBP组灌胃500 mg/kg米糠多糖,另两组以等量水灌胃。饲喂11周后发现:HFD+RBP小鼠体重、肝重、脂肪垫重量均明显低于HFD组且略高于对照组。小鼠血样检查后发现:米糠多糖能显著降低高脂饮食引起的总甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇升高,但米糠多糖升高高密度脂蛋白胆固醇浓度较HFD组不显著。小鼠肝脏H&E染色检查发现:米糠多糖能使高脂饮食下排列松散,体积增大且有脂肪空泡的肝脏细胞排列更紧密且减少脂肪空泡的形成,使其形态更接近于对照组。小鼠腹部脂肪垫的H&E染色结果发现:高脂组小鼠脂肪细胞显著大于对照组,米糠多糖保护组小鼠脂肪细胞显著于小于高脂组。提取各组小鼠肝脏的mRNA和蛋白分别进行基因芯片分析、脂代谢关键基因的RT-PCR和蛋白免疫印迹实验。基因芯片分析显示,RBP干预使高脂饮食小鼠肝脏组织中93个基因上调,72个基因下调。GO分析显示米糠多糖引起差异化表达的基因在代谢过程、呼吸链、ATP酶等GO条目中出现富集;KEGG通路分析显示米糠多糖可能干预了高脂饮食小鼠肝脏组织中的P450细胞色素通路、化学致癌通路、PPAR通路和留体激素通路等的调节;IPA软件分析显示脂代谢通路是米糠多糖影响排名第二的通路,共有35个脂代谢通路中的基因受到了米糠多糖的影响。IPA关联网络预测图还显示NF-κB复合体在米糠多糖在肝脏内的降脂过程中可能起到了中心枢纽的调控作用。RT-PCR显示米糠多糖上调高脂饮食小鼠肝脏组织中PPARα和PPARδ mRNA相对表达量,同时下调PPARy、SREBP-1C、FASN、ACC、SIRT和CD36等基因的mRNA相对表达量,使它们的表达都更趋向于对照组的表达,从而起到降脂的作用。蛋白质印迹分析进一步证实了米糠多糖处理后的这些基因蛋白表达也发生相应改变。这些结果说明米糠多糖对肝脏基因表达谱和脂代谢关键基因起到了调控作用,从而减轻了高脂饮食动物的高血脂症表型。3.米糠多糖对HepG2细胞的降脂作用及分子机理为了从细胞层面观察米糠多糖的降脂作用,本研究利用HepG2细胞模型,观察米糠多糖对经过油酸处理后的HepG2细胞脂肪积累的抑制效果。首先,MTS分析和DAPI荧光染色显微镜发现0-200 μg/ml米糠多糖对HepG2细胞的活性无显著影响。油红O染色结果表明25、50、100 μg/mL米糠多糖能显著抑制HepG2细胞中的脂肪累积,且呈剂量依赖关系。RT-qPCR结果发现米糠多糖能上调高脂环境中HepG2细胞中PPARα和PPARδ的mRNA相对表达量,同时下调PPARy、SREBP-1C、FASN、ACC、SIRT和CD36等基因的mRNA相对表达量,从而起到减少细胞内油脂积累的作用。Western blot结果发现蛋白的表达趋势与mRNA的上下调关系基本一致,说明米糠多糖对脂代谢关键基因的转录和翻译起到了调控作用,从而减少了肝脏细胞内油脂的积累。4.米糠多糖减少由高脂饮食引发的低度炎症及其分子机理医学证据表明身体在肥胖发生的同时往往伴随产生低度炎症。本研究表明高脂饲料不仅可以诱导小鼠产生高脂血症并导致肥胖;还对小鼠肝脏的炎症因子表达具有刺激作用。解剖发现:高脂组小鼠脾脏显著大于对照组,而米糠多糖保护组脾脏相对较小;RT-PCR发现高脂组小鼠肝脏的TNF-α、IL-6和iNOS的mRNA都上调表达;而米糠多糖能显著降低炎症因子的表达量。Western blot也从蛋白水平佐证了米糠多糖对这些基因的调控。这些结果表明米糠多糖可能减少高脂饮食伴随的炎症反应的发生。