【摘 要】
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在高浓度铜的环境里种植的、加利福尼亚西红柿中出现的革兰氏阴性菌中发现的铜伴侣CopC含有102个氨基酸残基,分子量约为10 kDa。核磁结构显示,结合Cu2+和Cu+的CopC在溶液中呈希腊桶状结构,由9股β折叠片形成,两股是平行的,剩下的是反平行的。CopC含有一个疏水的内核,其中含有唯一的Trp83和Tyr79。CopC对Cu+和Cu2+都有很高的亲和性。Cu2+的结合位点位于CopC的N末端
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在高浓度铜的环境里种植的、加利福尼亚西红柿中出现的革兰氏阴性菌中发现的铜伴侣CopC含有102个氨基酸残基,分子量约为10 kDa。核磁结构显示,结合Cu2+和Cu+的CopC在溶液中呈希腊桶状结构,由9股β折叠片形成,两股是平行的,剩下的是反平行的。CopC含有一个疏水的内核,其中含有唯一的Trp83和Tyr79。CopC对Cu+和Cu2+都有很高的亲和性。Cu2+的结合位点位于CopC的N末端,由His1、His91、Glu27、Asp89四个氨基酸残基组成。桶的另一端是Cu+结合位点,由Met40、Met43、Met46和Met51四个氨基酸残基组成。CopC作为氧化还原开关参与铜的调控,CopC与小分子的相互作用将影响CopC对铜的调控。本文在本实验室之前研究的HSSC(SSC,水杨醛缩氨基磺酸-阴离子),L1(2,6-吡啶二甲酰肼2-羟基萘甲醛酰腙)和姜黄素与CopC的相互作用的基础上,重点研究了阿霉素与CopC的相互作用及一些小分子对CopC作为氧化还原开关的影响。首先,本文研究了CopC和阿霉素(ADM)的相互作用。荧光光谱、等温滴定量热法(ITC)分析表明CopC和ADM以1:1结合,条件稳定常数约为105 L/mol;红外光谱、CD光谱和尿素诱导解折叠实验研究表明阿霉素的结合导致CopC的构象变化,伴随着β-折叠的减少和无规卷曲的增加,CopC的稳定性降低;通过分子对接软件Arguslab模拟发现,ADM与CopC之间主要作用力是氢键和疏水作用力,并且ADM的结合位点位于蛋白质的N端。其次,本文研究了Cu2+和ADM、ADM-CopC的相互作用,荧光光谱、紫外-可见吸收光谱、等温滴定量热、荧光寿命分析表明Cu2+和ADM以1:2结合,累积条件稳定常数K[Cu(II)-ADM]为1.90×109 L2/mol2;动力学和热力学实验共同表明Cu2+,ADM和CopC可形成CopC-Cu2+-ADM三元复合物,并且这个三元复合物以Cu2+为中心。最后,本文研究了ADM、HSSC、L1、姜黄素对CopC铜调控的影响。紫外还原动力学表明,小分子影响CopC铜调控的主要因素有Cu2+的还原及Cu+的迁移。结合在CopC的C端的HSSC、结合在CopC的N端的L1和ADM与CopC的结合均会改变CopC的构象,扩大了CopC桶内Cu+的迁移通道的出口和入口,使得Cu+容易迁移,而结合在CopC疏水桶中部外侧的姜黄素没有改变Cu+的迁移通道,不影响Cu+的迁移速率;通过构建疏水桶中央的氨基酸突变,85位的丙氨酸突变成甲硫氨酸,可形成桶内Cu+弱结合位点,使得Cu+的迁移更容易进行,这都表明CopC-Cu2+的还原途径可能是内途径。
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