论文部分内容阅读
目的研究磷酸钙骨水泥/聚乳酸羟基乙酸复合微球(Calcium phosphate cement/poly(lactic -co-glycolic acid) microspheres,CPC/PLGA )的降解液对成骨细胞增殖的影响及成骨细胞相关因子RANKL及OPG表达的作用,从而为进一步阐明PLGA促进CPC降解的机制提供理论依据。方法第一部分:PLGA和CPC/PLGA降解乳酸和羟基乙酸浓度的选择一、PLGA和CPC/PLGA降解乳酸和羟基乙酸的浓度变化(1) PLGA降解液的制备将0.4gPLGA粉末放置于5mL DMEM完全培养基,并于5%C02,37℃培养箱中培养,分别于15d、30d、45d、60d、75d后收集液体,用高效液相色谱仪(HPLC)检测乳酸和羟基乙酸含量。(2) CPC/PLGA降解液的制备称取400mgCPC/PLGA混合物加入200μlNa2HPO4溶液进行调拌,并加入5mlDMEM完全培养基,于5%CO2, 37℃培养箱中共培养,分别于15d、30d、45d、60d、75d后收集液体,用高效液相色谱仪(HPLC)检测乳酸和羟基乙酸含量。二、各实验组乳酸和羟基乙酸浓度的选择通过高效液相色谱仪(HPLC)测量各组PLGA和CPC/PLGA降解生成的聚乳酸和羟基乙酸浓度,用MTT实验筛选适宜成骨细胞增殖的浓度。再根据MTT实验结果选择羟基乙酸和乳酸的最终浓度进行后续实验。第二部分:CPC/PLGA降解液对成骨细胞的影响取24h之内的SD乳鼠颅骨,通过两步消化法获得成骨细胞,在含有血清的DMEM培养液中进行培养。本实验分为四组:1.对照组(成骨细胞);2.CPC组(CPC+成骨细胞);3.PLGA组(PLGA+成骨细胞);4.CPC/PLGA组(CPC/PLGA+成骨细胞),将四组降解液与成骨细胞共培养。利用四唑盐比色试验(MTT)检测第1、3、5、7、9天时,各组的吸光度值,并绘制生长曲线,计算相对增殖率。并通过茜素红钙结节染色(21d)、碱性磷酸酶活性检测(分别培养1、3、5、7d)和PCR检测骨钙素含量(分别培养1、3、5、7d)来探讨CPC、PLGA及CPC/PLGA复合物降解初期对成骨细胞增殖和分化能力的影响。通过RT-PCR检测细胞中RANKL mRNA和OPGmRNA的表达,探讨CPC/PLGA降解初期对成骨细胞相关因子RANKL和OPG的作用,试图阐明RANKL-RANK-OPG调控轴是如何受到PLGA影响,从而促进CPC产生降解的机制。结果1. PLGA降解液中乳酸和羟基乙酸的浓度在PLGA浸泡至45d时,羟基乙酸浓度为(23.685±0.54)mg/L,乳酸浓度为(3.996±0.57)mg/L。2.CPC/PLGA降解液中乳酸和羟基乙酸的浓度CPC/PLGA降解液中羟基乙酸的浓度从15d的(2.028±0.049)mg/L开始顺着时间的推移出现提升,60d时到达峰值(7.320±0.034) mg/L,随后逐渐下降75d时为(4.256±0.046) mg/L。而乳酸浓度变化趋势不明显,降解曲线近乎平缓:15d 时为(0.171±0.024) mg/L,45d 为(0.14±0.051) mg/L ,而到 75d 为(0.091±0.038) mg/L。3.CPC/PLGA降解液对成骨细胞的影响根据MTT实验结果显示,成骨细胞在培养的第三天进入对数生长期,而到了第七天曲线变得平缓,细胞增殖速率减慢。CPC组和CPC/PLGA组与CON组相比,增殖能力有所增强(P<0.05) ;PLGA组与CON组相比,增殖能力降低(P<0.05)。PLGA组与其他三组相比,经过21d培养后钙结节沉淀不明显。CPC/PLGA组碱性磷酸酶活性在3、5、7d均高于对照组(P<0.05),且明显高于PLGA组(P<0.01) ; PLGA组低于空白对照组(P<0.05)。RT-PCR结果显示:CPC/PLGA组骨钙素的表达在3、5、7d均高于其它三组(P<0.05) ; PLGA组在5、7d低于空白对照组(P<0.05)。成骨细胞在培养的1、3、5、7d里,CPC/PLGA组和PLGA组RANKL表达高于CON组(P<0.05),CPC组与CON组相比RANKL表达差异不明显;相比于CON组CPC/PLGA组RANKL的表达水平在3d时处于高峰期(P<0.01),PLGA组RANKL的表达水平在7d时处于高峰期(P<0.01)。成骨细胞在培养的1、3、5d里,CPC组OPG的表达逐步上调,且高于CON组(P<0.05),在第7d时开始降低;CPC/PLGA组OPG表达水平在5d后开始快速增加,明显高于CON组(P<0.01)在 7d 时到达峰值(P<0.01)。PLGA 组在 1、3、5、7d 里 OPG的表达低于CON组(P<0.05)。结论CPC/PLGA降解液在细胞增殖早期能够上调成骨细胞上RANKL因子的表达;