论文部分内容阅读
背景:龋病是常见病、多发病,而牙菌斑生物膜是人类龋病的始动因子。细胞外多糖特别是不溶性胞外多糖对生物膜的结构起决定作用,如:促进细菌黏附,促进生物膜的形成和发展,以及在疾病发生和细菌共生集聚形成中起重要作用等[1]。因此,研究细菌在生物膜状态下胞外多糖的合成情况对研究龋病的病因及预防有重要意义。很多学者正在寻找一些新的抗菌方法预防龋病,其中应用潜力较大的就包括光动力学疗法（PDT,photodynamic therapy）。我们采用对红光比较敏感的甲苯胺蓝（TBO,Toluidine blue O）作为光敏剂[2],分析人工菌斑生物膜在1%蔗糖条件下产生胞外多糖的情况,并与目前临床常用的化学处理方法进行对比,初步探讨PDT用于预防龋病的可行性。目的:本研究将借鉴国内、外研究成果,进一步探索光动力学疗法对常见致龋菌游离状态下生长抑制敏感性,初步探讨对牙周组织的安全性,在此基础上分析人工菌斑生物膜在1%蔗糖条件下产生胞外多糖的情况,并与目前临床常用的化学处理方法进行对比,为PDT进一步研究提供一定的理论依据。材料与方法:1远缘链球菌,粘性放线菌的诱导。将冻干保存的菌种远缘链球菌（S.s）和粘性放线菌（A.v）接种于BHI培养基中,37℃厌氧环境（80%N2,10%H2,10%CO2）培养48h,革兰染色镜检及生化鉴定并分离,分别移取大小形态一致的菌落溶于BHI液体培养基中,再次接种在BHI血琼脂培养基上,37℃厌氧环境（80%N2,10%H2,10%CO2）培养48h后,按照NCCLS标准方法,用比浊仪将其调整为0.5McFarland的标准菌液（相当于1.5×108CFU/ml）菌悬液,备用。2远缘链球菌,粘性放线菌的体外抑菌实验。在暗室中,在四十八孔细胞培养板中每孔加900μl不同浓度的TBO,将0.5McFarland的标准两种细菌菌液分别稀释100倍成1.5×106CFU/ml,取100μl菌悬液加入各孔中,根据分组情况进行实验后,从孔板中移取100μl液体用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释100倍,再取20ul滴于TSA琼脂培养板,分区各滴3次,48h后读取菌落计数结果。分组情况为:1组试样作为对照组不进行任何处理;2组试样采用甲苯胺蓝（TBO）50μg/ml,100μg/ml处理;3组试样行二极管激光（LED）15min（相应能量传递为94.5 J/cm2）,25min（相应能量传递为157.5 J/cm2）处理;4组试样行PDT处理,即50μg/ml,100μg/ml TBO,15min,25min LED分别相互作用。3光动力学疗法作用于人工菌斑生物膜后细胞外多糖分析。3.1人工菌斑生物膜的制备在6孔细胞培养板两侧的孔中加入消毒后的液态琼脂,待其硬固后,将22mm×11mm消毒后的盖玻片垂直插入琼脂中,每孔插3片,然后放线菌菌悬液与BM-5培养基按1:9（V/V）的比例混合加入6孔板中,每12h用新鲜的BM-5培养基换液一次,4天后同法加入乳杆菌,再经过4天后同法同时加入变形链球菌和远缘链球菌,在经过4天涂片观察混合生物膜制备形成。分组同上单细菌敏感性实验,加第5组试样:0.1%洗必泰作用15 min。3.2胞外多糖的分析将上述盖玻片从6孔板中取出分别置于含有10ml 10g/L蔗糖的TSA液体培养基中,37℃厌氧培养18h,刮除并收集盖玻片上的细菌连同培养液4℃下以750×g离心30 min,弃上清液。细菌沉淀物用5 ml蒸馏水洗涤,再离心2次,合并上清液,即水溶性多糖;水洗后的细菌加人5 ml 0.4 mol/L的NaOH洗涤,离心3次,合并上清液,即水不溶性多糖。取适量上清液,用蒽酮法测定胞外多糖的含量[3]。4光动力学疗法对小鼠牙周组织的影响。将54只小鼠随机分为9组,实验分组为:50μg/ml,100μg/ml TBO分别联合二极管光照（LED）15min,25min光动力疗法组;15min,25min LED分别单独辐照组,50μg/ml,100μg/ml TBO分别单独作用组以及没有LED和TBO作用的空白对照组。各实验组作用后72h,切取牙周组织切片观察。结果:1远缘链球菌抑菌率:TBO 50μg/ml,作用15min、25min抑菌率分别是89.13%、91.30%。TBO 100μg/ml,作用15min、25min抑菌率分别是94.02%、96.20%,单因素析因方差分析后F=2.88 P<0.05,存在交互效应。放线菌抑菌率:TBO 50ug/ml,作用15min、25min抑菌率分别是64.71%、91.18%。TBO 100ug/ml,作用15min、25min抑菌率分别是91.18%、88.24%,单因素析因方差分析后F=9.95 P<0.05,存在交互效应。2经过PDT作用后,水不溶性胞外多糖:各组和对照组均无显著性差异（P>0.05）,洗必泰组和对照组有显著性差异（P<0.05）;水不溶性葡聚糖:各组和对照组均无显著性差异（P>0.05）,洗必泰组和对照组有显著性差异（P<0.05）。3 72 h内,各组小鼠均无死亡、惊厥、呼吸抑制、腹泻等,牙龈未见炎症,溃疡,增生等改变,进食正常。经过TBO不同剂量和二极管激光照射不同时间的小鼠牙龈上皮组织,结缔组织,骨组织均完整,镜下未见异常改变,与对照组表现相同,未见如炎症,增生,溃疡,坏死,血管破坏等软组织异常,而且牙齿,牙槽骨未见异常。结论:1光动力学疗法对游离状态的远缘链球菌和粘性放线菌抑菌率达到90%以上提示光动力学疗法是敏感的。2本研究表明PDT不能像0.1%洗必泰明显减少胞外多糖的量,且不能完全杀死细菌,说明PDT对细菌的作用远远低于0.1%洗必泰,我们认识到PDT虽然能抑制部分细菌,但是几小时后就可能恢复到原来的水平,但是0.1%洗必泰可以应用到家庭护理治疗,因此关于PDT仍然需要大量的改进研究。3光动力学疗法对小鼠牙周组织未见明显异常。