论文部分内容阅读
本研究以抗寒性极强的新疆沙冬青为材料,克隆得到了抗寒相关的酶蛋白基因AnGPAT全序列和抗逆转录因子基因AnICEa和AnICEb的部分序列,并对各基因进行了序列分析及分子进化分析,同时对AnGPAT基因进行了原核体外表达和转基因载体构建。为不同抗寒基因的协同作用机制研究,以及抗逆新基因的发掘与基因工程育种奠定了基础。主要结果如下：1.经同源克隆和RACE方法成功克隆了新疆沙冬青GPAT基因的cDNA全序列,命名为AnGPAT。其基因全长1482 bp, ORF长1380 bp,编码一个由460个氨基酸残基组成的多肽。对该基因编码的氨基酸进行分析,预测分子量为50.9KD,等电点为7.38。保守性功能区搜索发现从201到436位氨基酸残基为GPAT保守功能域(LPLATs)。进化分析表明,AnGPAT与蚕豆(Vicia faba)和油棕(Elaeis guineensis) GPAT蛋白亲缘关系最近。2.经同源克隆和染色体步移技术获得了两个同源ICE基因,分别命名为AnICEa和AnICEb.在两基因中都发现了ICE基因保守功能域bHLH。对不同物种ICE基因编码的氨基酸全序列和C端序列同源比对后进化分析表明：AnICEa与大豆(Glycine max) ICE蛋白聚为一类,AnICEb与萝卜(Raphanus sativus),拟南芥(A.thaliana) ICE蛋白亲缘关系较近。3.将AnGPAT基因的开放阅读框插入表达载体pET-30 a(+)的MCS区,获得了pET-30a-GPAT大肠杆菌表达载体。转化大肠杆菌BL21后,在37℃经1 mM IPTG诱导后获得一个大约51 kDa的融合蛋白,和预测大小一致。4.通过构建中间表达载体pGM-35S-GPAT-NOS,使得AnGPAT连接上强启动子和终止子。把35S-GPAT-NOS片段插入到pCAMBIA2300的MCS区,成功构建了p2300-35S-GPAT-NOS真核表达载体。为后续利用转基因技术进行基因功能研究奠定了基础。