研究背景结直肠癌(CRC)是全球性三大恶性肿瘤之一,传统的治疗包括手术、化疗、靶向治疗和放疗等,尚不能有效地控制肿瘤的进展和转移。目前常用的化疗药物和靶向药物存在毒副作用强、易产生耐药等尚未解决的难题,故很有必要研发安全有效抗肿瘤的中药新药。“创新中药安留克胶囊(低极性人参皂苷ALK)的研发”在“十一五”重大新药创制专项的资助下,完成了候选药物研究,及新药临床前研究的大部分工作,现制备工艺稳定,中试产品质量可靠,成分含量明确,主含F4、Rh4和R-Rg3等5个低极性人参皂苷单体,急性和长期毒理学研究均表明其毒性很小,发明专利被授权。鉴于低极性人参皂苷ALK抗结直肠癌的作用尚未明确,本文首次通过动物模型、细胞学和分子生物学等多层次系列实验,拟证实ALK体内外抗肠癌的有效性,并以肿瘤微环境的核心免疫树突状细胞(DC)为切入点,研究ALK通过诱导DC分化成熟及功能激活而参与抗肠癌的免疫调控。为扩大ALK的功能主治提供实验依据,ALK可望开发为安全有效抗白血病和结直肠癌的中药新药或辅助药物。研究方法1..ALK体外抑制肠癌细胞增殖、阻滞周期及诱导的基因表达谱研究用药中间体ALK干燥粉剂(成品为安留克胶囊)由浙江省中医院新药研发项目组提供,以人肠癌细胞株HT29、SW480和SW620为靶细胞,经不同浓度的ALK(中间体干燥粉剂)处理后,集落生成试验和MTT比色法检测ALK抑制肠癌细胞的增殖;流式细胞术分析ALK阻滞细胞增殖周期。激光共聚焦显微镜观察干扰素诱导的跨膜蛋白-1(IFITM1)表达;以及基因芯片分析ALK诱导的基因表达谱。2.ALK在荷瘤裸鼠模型体内抗肠癌的研究采用HT29-GFP细胞制备肠癌荷瘤裸鼠模型,分为模型组、ALK低、中和高剂量(50、100和200mg/kg)治疗组及阳性药物(卡培他滨化疗药、参一胶囊中成药)对照组。治疗7d、14d,小动物活体成像测定各组瘤体的荧光信号值、瘤体积和瘤重,瘤组织病理检查。实时定量RT-PCR、Western blot和免疫组化等方法,检测移植瘤组织肿瘤相关基因及其蛋白的表达水平。3.诱导树突状细胞分化成熟及功能激活的研究体外培养小鼠骨髓单个核细胞来源的BMDC,经免疫磁珠分离纯化并鉴定。流式细胞术分析ALK促进DC分化成熟的细胞表型;荷瘤裸鼠模型经ALK低、中和高剂量治疗后,免疫荧光法观察瘤组织及其周边成熟DC表面标志CD83蛋白的表达。研究结果1.细胞学和基因表达谱实验证实ALK抗肠癌的有效性1.1 集落生成试验显示 ALK25、50、75 和 100mg/L 对 HT29、SW480 和 SW620肠癌细胞的抑制率分别为14.47±3.74%～100.00±0%(P分别<0.05,0.01),ALK抑制三株细胞的IC50分别为55.86、57.95和63.96mg/L。MTT测定显示ALK 50、75、100 和 150mg/L 的抑制率分别为 21.45±6.16%～96.42±1.09%(P分别<0.05,0.01),ALK抑制三株细胞的IC50分别为88.20、97.32和91.08 mg/L;均提示ALK能够有效地抑制肠癌细胞增殖,呈剂量依赖性。1.2 ALK 50、75和100 mg/L有效地阻滞HT29、SW480细胞进入增殖周期,停滞于G0/G1期,G0/G1期细胞比例显著增高(P分别<0.05,0.01)。而S期细胞比例则明显下降(P分别<0.05,0.01),增殖指数也明显低于对照细胞(P分别<0.05,0.01)。表明ALK通过阻滞细胞周期而抑制肠癌细胞增殖,呈剂量依赖性。1.3HT29、SW480肠癌细胞本身表达IFITM1跨膜蛋白,呈绿色荧光强阳性反应,ALK作用后,绿色荧光强度均明显减弱;HE染色集落细胞形态也有变性和退化现象,均表明肠癌细胞的生长和转移受到抑制。1.4基因表达谱分析显示ALK诱导与肿瘤相关差异表达的基因,通过上调抑癌基因及DNA损伤修复基因AKR1B10、p53、CDKN1A、ATF3和PER1等,下调肿瘤迁移和信号通路相关ANLN、DKK1和ERCC6L基因,从而抑制肠癌细胞增殖及转移。2.ALK在荷瘤裸鼠模型体内抑制肠癌瘤体生长的作用2.1 ALK有效地抑制癌细胞在荷瘤裸鼠模型体内的增殖和生长,低、中和高剂量治疗组的瘤重量和体积均明显低于未治疗模型组(P均<0.01);而体重均高于卡培他滨化疗组和参一胶囊中药组(P均<0.05),提示ALK不但有效地抑制肿瘤生长,而且对提高生活质量有一定的优势。2.2 ALK中、高剂量组治疗7d,荷瘤裸鼠体内瘤体荧光强度明显低于模型组(P分别<0.05,0.01)。治疗14d,ALK三个剂量组的瘤体荧光强度均明显低于模型组(P均<0.05,0.01)。病理检查显示ALK中、高剂量组的瘤组织有变性和退化,细胞密度明显下降,均表明其在荷瘤裸鼠模型体内的抗肠癌作用。2.3ALK治疗荷瘤裸鼠模型,可通过上调瘤组织抑癌基因p53、MCC和DCC mRNA及其蛋白的表达;下调癌基因c-Myc的mRNA及其蛋白的表达,从而发挥其抗肠癌的作用。3.诱导DC分化成熟及功能激活的作用3.1小鼠骨髓来源的BMDC经ALK处理后,DC表面分化标志CD83、CD86阳性细胞率显著增加(P<0.05),提示ALK可通过促进小鼠骨髓来源DC的分化成熟,而介导抗肠癌的免疫应答。3.2荷瘤裸鼠模型经ALK治疗后,瘤体外周边缘红色荧光阳性反应的CD83蛋白表达量显著增加,提示ALK可通过增加DC在肠癌瘤体周边的浸润,而介导抗肠癌的免疫应答。结论1.首次采用体外细胞增殖试验和基因表达谱分析,证实ALK抗肠癌的有效性,揭示其通过抑制肠癌增殖、阻滞细胞周期,上调抑癌基因及下调癌基因而发挥其抗肠癌的作用。2.ALK在荷瘤裸鼠模型体内也具有抗肠癌的作用,使瘤体积明显缩小,瘤体荧光信号强度显著减弱,瘤组织有变性退化,细胞密度明显下降等现象。同时,通过上调瘤组织抑癌基因p53、MCC和DCC的mRNA及其蛋白的表达水平,下调癌基因c-Myc的mRNA及其蛋白的表达水平,从而发挥其抗肠癌的作用。3.ALK体外能够有效地诱导小鼠髓系DC的分化成熟,并提高功能活性,在荷瘤裸鼠模型体内可通过增加DC在肠癌瘤体周边的浸润,而介导抗肠癌的免疫应答,揭示ALK可发挥多功能及多靶点的抗肠癌作用。