免疫荧光微流控传感芯片及其应用研究

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高性能生物传感对重大疾病和传染病的诊疗至关重要。降低重大疾病和重大传染病死亡率,提高治愈率,早诊治是唯一的方法。通常情况下,早期疾病标志物含量极低,且一种疾病标志物会与多种疾病相关联,因此,开发一种高灵敏度、高通量和低成本的疾病标志物检测平台对于重大疾病和重大传染病的早期诊断、预防与治疗具有重要意义。本论文主要研发了一种集成氧化石墨烯量子点(GOQDs)纳米材料的免疫荧光微流控生物传感芯片,并对其在肿瘤抗原标志物检测、新冠抗原/抗体检测和疾病相关外泌体检测中的应用进行了深入研究。主要创新性研究成果如下:(1)构建了基于传感基底修饰和抗体组装新方法的微流控生物传感芯片,首次提出了氧化石墨烯量子点(GOQDs)的纳米材料自组装传感基底和固相二维平面荧光信号扫描新模式。通过抗体/抗原微印刷技术,在芯片基底上形成微米级分辨率的多种抗体或抗原阵列,结合样本加载双层微流控芯片,实现多种标志物同时检测。研究结果表明,氧化石墨烯纳米材料组装的传感基底具有95%以上的均一性和一年以上的稳定性,整体性能优于国际上常用的聚赖氨酸基底;集成氧化石墨烯纳米材料自组装基底的微流控传感芯片单片可以实现在40分钟内同时进行60个样本的多种标记物检测,每个样本最多可以同时检测20种标记物,检测重复性超过90%,样本和试剂消耗量少,检测成本是传统检测方法的1/10-1/100,为多个临床样本的多种生物标志物的超灵敏、快速和高通量检测打下坚实的基础。(2)将微流控生物传感芯片用于多种肿瘤标志物的高灵敏、高通量快速检测中,构建多种肿瘤标记物检测微流控传感芯片,实现了乳腺癌肿瘤标志物CEA、AFP、CA125、CA199 和 CA153 的联合检测,检测限分别为 1.08 pg/mL、1.02 pg/mL、0.01 U/mL、0.05 U/mL和0.03 U/mL。通过临床实际样本的检测对比分析,研发的肿瘤标志物微流控传感检测芯片对临床样本的检测结果与罗氏电化学发光自动化检测设备进行了对比,检测结果相关系数的平方R2均大于0.99。结果显示研制的肿瘤标志物检测微流控传感芯片的整体检测性能优于目前医院使用的罗氏电化学发光全自动检测仪器。(3)论文将构建的微流控生物传感芯片应用到SARS-CoV-2抗原/抗体的检测中,构建了 SARS-CoV-2抗原/抗体生物传感芯片。SARS-CoV-2抗原/抗体生物传感芯片具有5个数量级的线性检测范围,良好的特异性和~0.23 pg/mL的超低检测限,可以在小于10分钟的时间内实现SARS-CoV-2抗体/抗原的定性检测。通过与商用ELISA检测方法比较,对比检测数据结果显示,荧光传感芯片与商业ELISA试剂盒的检测结果一致性高,其回标率为97.19-103.01%。将该生物传感平台成功应用于接种新冠疫苗血清的分析检测,未接种疫苗者和接种疫苗者血清样本的统计学分析结构显示,双侧t检验p<0.0019,表明具有良好的统计学差异。与ELISA相比,免疫荧光微流控生物芯片法具有检测时间短、检测限低、试剂和样本消耗量小等优点,不仅可以应用于COVID-19患者的快速诊断,与核酸检测进行互补,而且还可以为感染患者、药物治疗和疫苗接种者快速提供有基于抗体的精准评估。(4)论文进行了微流控生物传感芯片在乳头溢液外泌体检测中的应用研究。采用双阳性检测的方法,通过识别外泌体膜蛋白CD63、CD9、CD81及上皮细胞黏附分子EPCAM,针对MDA-MB-231、MCF-7、MCF-10A三种细胞系、患者乳头溢液、患者血清和健康人临床样本进行了外泌体捕获富集与检测的研究。通过对不同浓度外泌体样本的检测,验证了传感芯片的超宽检测范围(4.1 × 106 particles/mL-2.1 × 109 particles/mL)和超低检测限为5.12 ×104 particles/mL。芯片的外泌体富集效果与标准NTA粒径分析方法(样本量需求大,临床乳头溢液样本比较微量,不适合用该方法进行分析)相比,具有很好的一致性,标准偏差在10%以内。微流控传感芯片从外泌体富集到外泌体检测整体时间只用40min。临床样本检测结果表明构建的微流控外泌体生物传感芯片具有优异的检测性能。更重要的是乳头溢液样本量极少,很多患者只有几微升,常规检测方法根本无法检测,微流控传感芯片只用2 μL样本可以实现多参数检测,在临床外泌体的检测分析及重大疾病辅助诊断等领域具有巨大的应用潜力。(5)本文将微电子技术、纳米技术、光电技术和生物医学技术相融合,提出了一个基于固相氧化石墨烯量子点(GOQDs)集成微流控免疫荧光检测芯片的通用生物传感平台,通过结合独特的纳米结构,对传感芯片检测条件的优化,提高了传感芯片整体的检测性能,从而扩大了应用范围。实现对疾病多种生物标志物的超灵敏、快速和高通量检测。为癌症早期筛查,精准诊断,精准治疗及预后跟踪提供了快速低成本检测的解决方案,应对不同种类的环境与生物复杂样品的分析,一方面需要提升传感机制的选择性与灵敏度,另一方面需要增强的平台上进行样品前处理的功能,使得芯片的功能更加完善,实现自动化的分析检测,做出更多努力将生物传感器从实验室推向市场。
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