蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)是在生物体和细胞内广泛表达的丝—苏氨酸磷酸酶家族成员之一。通过对细胞生物过程中关键调控蛋白的去磷酸化作用，该磷酸酶家族参与许多生物学过程包括细胞增殖、细胞分化、细胞周期、转录、RNA剪接、翻译、DNA修复、细胞代谢、信号转导及凋亡等的调控。PP2A是由1个核心酶和1个调节B亚基构成的异源三聚体复合物。PP2A核心酶(PP2AD)是一个异二聚体，包括1个36kD的催化C亚基(PP2A—C)和1个65kD的支架A亚基(PR65或PP2A—A)；核心酶中催化C亚基和支架A亚基的表达影响PP2A的功能活性。核心酶二聚体以独立或与第三种可变的调节亚基结合的形式存在，其中与核心酶结合的调节B亚基(PP2A—B)有4个亚家族：B、B’、B”、B”’，决定了该酶的不同底物特异性。 研究表明，PP2A在肿瘤发生发展中具有重要作用，参与致癌过程中细胞的诱导性转归及其调控，因此成为毒理学致癌作用机制研究的热点问题之一。近来关于PP2A在致癌过程中作用的研究认为PP2A是一个潜在的肿瘤抑制因子。在人类黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、神经胶质瘤、结肠癌、人类多发性骨髓瘤和上皮鳞状细胞癌的肿瘤细胞中均发现有PP2A不同亚基的基因突变或PP2A调节功能的改变。引起我们关注的是，目前对PP2A—Aα亚基基因(PPP2R1A)的研究主要集中在其编码基因的功能研究上，而对PPP2R1A基因启动子区(PPP2R1Ap)的研究报道很少，特别是对人群中该基因启动子区的多态性及其单体型分布国内外还未见报道。 随着人类基因组计划(Human Genome Project，HGP)的实施和完成，为目的基因的多态性研究提供了宝贵的资料和公共资源，使基因多态性成为人类基因组最丰富的遗传变异。其中以在随机人群中出现1％以上频率的某个单核苷酸的差异称为基因多态性(polymorphism)，人类基因组的多态性中最常见、最主要的是基因组中单个核苷酸的变异，即单核苷酸多态性(single mucletide polymorphisms，SNPs)，包括单碱基的转换、颠换、插入和缺失。多态性在人类基因组中广泛存在，据估计在每千个碱基就有1个多态性位点，因此，其总数将超过300万。最初多态性主要运用在与人体重要疾病的关联性研究中，随着检测技术不断提高以及SNP数据库的不断完善，特别是毒理基因组学(toxicogenomics)的出现和日臻成熟，外源化学物代谢酶以及致癌过程相关目的基因的多态性研究已成为目前毒理学领域研究的焦点和热点。 单体型(haplotype)是位于一条染色体特定区域的一组相互关联并倾向于以整体遗传给后代的SNP的组合。单体型既是人群遗传变异的内在特征、又是决定基因性状的功能单位；同时，由于结合了多个遗传学变异位点的信息以及它们之间连锁不平衡的关系，使得单体型分析在关联研究中可获得更强的力度。因此，毒理学相关目的基因多态性单体型分析，近年来更多地成为毒性损伤易感性和致癌相关研究、以及复杂性状疾病关联研究中的重要方向。 综上所述，本课题拟首先筛查正常人群中PPP2R1A基因5’—侧翼区潜在的基因多态性位点，接着构建该目标人群的不同单体型，并进而在此基础上构建含有不同基因多态性单体型的报告基因重组质粒，进一步通过转染真核细胞进行该基因启动子区多态性单体型的功能分析。 研究目的: 通过对正常人群基因组中PPP2R1A基因5’—侧翼区的PCR扩增和直接测序，筛查并确证其5’—侧翼区基因多态性位点及建立单体型，对启动子区不同单体型的转录功能活性进行分析，探讨蛋白磷酸酶2A的核心酶Aα亚基基因(PPP2R1A)启动子区特定的基因多态性与转录调控的关系。 1.筛查正常人群基因组DNA中的PPP2R1A基因5'—侧翼区-1844nt～+201nt区域共2045bp片段中基因多态性位点。 2.分析该人群中目的基因多态性位点的遗传学特征，构建正常人群中PPP2R1A基因5'—侧翼区的不同多态性单体型。 3.构建目的基因启动子区(PPP2R1Ap)不同多态性单体型的报告基因重组质粒，转染细胞建立模型探讨其转录功能活性。 研究内容和方法: 第1章正常人群中PPP2R1A基因5'—侧翼区多态性位点的筛查1.1研究对象随机选取广东新兴县以及广州市无血缘关系的健康人群作为研究对象。 1.2目的基因序列的PCR扩增抽提目标人群的全血基因组DNA，建立PCR反应体系，扩增PPP2R1A基因5'—侧翼区-1844nt～+201nt区域(共2045bp)的目的片段，PCR产物纯化后直接进行再测序。 1.3正常人群中PPP2R1A基因5'—侧翼区多态性位点的筛查通过将测序结果与人类基因组数据库比对，确定该目的基因片段中的多态性位点及其等位基因型。 第2章PPP2R1A基因5'—侧翼区多态性位点的人群分布特征及其单体型分析2.1分析各多态性位点的人群分布特征，进行遗传多态性分析分析人群中PPP2R1A基因5'—侧翼区多态性位点的分布频率、基因型频率和等位基因频率、人群杂合度，并进行Hardy—Weinberg平衡吻合度检验及连锁不平衡分析。 2.2构建人群中目的基因多态性位点的不同单体型应用单体型分析软件(HaploView)对全目的片段成功测序的63例个体(共126条染色体)的PPP2R1A基因5’—侧翼区多态性位点进行单体型分析，构建该目标人群中不同多态性位点的单体型。 第3章PPP2R1A基因启动子区不同单体型报告基因重组质粒的构建及功能分析3.1不同单体型报告基因重组质粒的构建针对目的基因启动子区不同的多态性位点及其单体型，采用分子克隆的方法，分别构建不同长度的远端(L)、中端(M)、近端(S)启动子区不同单体型报告基因重组质粒，并通过测序及与Genebank和预测单体型比对进行确证。 3.2不同单体型报告基因质粒转染和功能分析应用脂质体介导方法将不同长度片段的报告基因重组质粒和pRL—TK共转染人鼻咽癌CNE1细胞株，进行Dual—Glow双荧光素酶报告基因检测，分析相对荧光素酶单位(RLU)，并进行不同单体型之间转录功能活性的分析比较。 3.3目的基因启动子区多态性位点的生物信息学分析采用计算机辅助分析(InSilicaAnalysis)，利用生物信息学软件对目的基因启动子区内基因多态性位点与潜在的转录因子结合位点的关系进行预测分析。 实验结果: 第1章正常人群中PPP2R1A基因5’—侧翼区多态性位点的筛查1.1目标人群的一般情况本研究对象共75例，均为居住在广东省广州市和新兴县的汉族健康人群，均无有毒、有害物质接触史。研究对象中男性37人，占总人数的49.7％，女性38人，占总人数的50.3％。其中年龄最小l5岁，最大55岁，平均年龄30.36±8.59岁。其中成功PCR和测序的共63例。 结论: 1.筛查出正常人群中PPP2R1A基因5’—侧翼区8个遗传多态性位点。其中有3个多态性位点尚未见报道。 2.构建了目标人群中PPP2R1A基因5’—侧翼区多态性的不同单体型。为功能活性分析提供理论基础。 3.目标人群中的中端和近端启动子区不同单体型存在功能活性差异。提示与Aα亚基表达和转录的调控有关，表明多态性单体型可影响启动子区的功能活性。