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核内不均一性核糖核蛋白K(Hnrnpk)是一个多功能蛋白,可以与RNA、DNA、蛋白质结合,调节DNA的转录、RNA的加工和翻译等,从而参与细胞的许多生物学过程,在轴突再生、精子发生、红细胞的成熟、卵巢发育、癌症发生等都起着关键调控作用,但在成肌分化过程中调节机制还不是很清楚。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术制备Hnrnpk基因敲除小鼠C2C12细胞株,将为系统阐明Hnrnpk基因介导的骨骼肌发育和再生的复杂网络调节机制提供模型,也为研究基因的功能和基因敲除小鼠提供一部分研究依据。本研究得到以下结果:1.利用gRNA在线设计软件,在Hnrnpk基因的外显子10处设计了两对gRNA。通过与pCAG-T7-Cas9载体进行酶连,构建Cas9/gRNA重组载体。通过PCR、TA克隆测序等多种方法验证了重组载体的正确性。将构建好的重组载体转染至C2C12成肌细胞,通过PCR扩增和T7EI酶切验证靶序列的切割效率。2.利用嘌呤霉素筛选稳转细胞,通过有限稀释法挑取Hnrnpk基因敲除的单细胞克隆,通过PCR和TA克隆测序确定突变位点及突变类型,共得到11株Hnrnpk基因突变的单细胞克隆,有两种突变类型:一种在靶位点2的PAM序列前缺失三个碱基TCG,另一种缺失了包括部分靶位点1和靶位点2的108个碱基。通过对突变体蛋白质序列及功能域进行分析发现:第一种突变只引起Hnrnpk蛋白非功能域部分一个氨基酸的缺失;第二种突变引起了Hnrnpk蛋白的KI结构域上36个氨基酸的缺失,进一步的western blot分析也表明第二种突变对应Hnrnpk蛋白分子量相应变小。因此,以108个碱基缺失的突变株为Hnrnpk基因敲除细胞模型对Hnrnpk的功能进行分析。3.对突变株进行形态学分析表明:相比于正常C2C12细胞,突变株细胞变的细长,触角减少,细胞分泌的杂质增多,细胞培养过程中出现较多的死细胞;MTT分析表明:突变株的增殖速率显著低于对照组(P<0.05),连续培养5天仍未进入接触抑制期;Ki67免疫荧光结果表明突变株的细胞活力显著低于对照组细胞。4.进一步用流式细胞仪检测细胞周期,结果表明突变株的细胞周期被阻滞在G2/M期(P<0.05),且由于细胞死亡导致突变株具有一个明显的亚G1期峰。5.对突变细胞进行2%的马血清诱导分化,发现细胞不能融合,且细胞死亡增多,不能形成肌管。进一步利用分化标志物MyHC进行免疫荧光分析,突变组细胞检测不到MyHC的表达。6.利用Illumina HiSeq 2000测序平台对对照组和突变株(clone 5)进行高通量转录组测序分析,共筛出差异表达基因2520个,其中上调表达基因793个,下调表达基因1727个。差异表达基因GO分析表明:在生物学过程中主要富集在生物调节、代谢过程、生物过程调节、应激反应、单细胞过程中;在细胞组分分类中主要在细胞、细胞组成、膜类、膜组成、细胞系等部分显著富集;在分子功能中,差异基因主要富集在结合和催化作用中。对差异表达基因的GO功能进行聚类发现,Hnrnpk基因敲除后细胞中增殖和分化相关基因的表达发生了显著变化(P<0.05)。差异表达基因的KEGG富集结果显示:共有829个差异表达基因富集到275个通路中,其中显著富集的通路有53个。主要富集的通路有免疫系统、信号转导和信号等。