肿瘤的生成是一个复杂的多步骤的过程,包括癌基因的激活和抑癌基因的失活。大多数上皮细胞肿瘤以纯合性缺失和包括16号染色体长臂(16q)在内的杂合性缺失(LOH)为特征。近年来,人类16号染色体的变异与上皮细胞恶性肿瘤的关系受到越来越多的关注。研究证实,16号染色体杂合子丢失(LOH)等变异频繁出现在乳腺癌组织中,并且在前列腺癌、肺癌等恶性肿瘤中也有同样发现。WWOX基因是新近在16号染色体16q23.3-24.1区域克隆出的一个基因,大小约1.1mb,跨越整个脆性位点FRA16D。研究表明,WWOX在多种恶性肿瘤组织和肿瘤细胞系中表达降低或缺如,提示WWOX为抑癌基因。基因敲除裸鼠研究还表明,WWOX不但是抑癌基因,并且WWOX的失活即可诱发肿瘤生成。　　 膀胱癌是我国临床上常见的肿瘤之一,是一种直接威胁患者生存的疾病。膀胱癌突出的生物学特性是其高复发性,凡保留膀胱的各种手术治疗,术后2年内超过半数的病人要复发,复发时约16％-25％恶性程度有增加的趋势。目前,临床上对膀胱癌的治疗方式主要采用以手术切除为主,结合灌注化疗、放射治疗和免疫治疗等的综合疗法有一定的治疗作用,但是效果,尤其远期疗效并不令人满意。随着肿瘤分子生物学和分子生物学技术的发展,作为攻克癌症的主要研究方向之一,基因治疗成为一种膀胱癌治疗的新手段。目前,在世界范围内已有一百余项基因治疗方案获准进入临床试验阶段,并取得较好的效果。相对于其他肿瘤,通过尿道可将基因载体直接置于膀胱肿瘤周围,为膀胱癌的基因治疗提供了更好地治疗方式。本实验应用体外研究的方法,探讨WWOX基因与膀胱肿瘤的关系,为膀胱移行细胞癌的治疗提供实验依据。　　 目的：　　 1、检测膀胱移行细胞癌组织标本及膀胱癌细胞株中WWOX蛋白、WWOXMrna的表达,探讨其在膀胱移行细胞癌发生发展中的作用;　　 2、采用基因工程技术构建整合有WWOX基因的真核表达载体,利用脂质体介导法在体外将WWOX基因导入人膀胱癌细胞系T24,并利用Western blot、RT-PCR检测转染后细胞的WWOX表达情况;　　 3、多种方法检测转染WWOX基因后膀胱癌细胞系增殖和凋亡情况及与化疗药物联合作用的关系。　　 方法：　　 一、实验材料　　 主要试剂:人膀胱癌T24细胞株购自中国细胞典藏中心;兔抗人WWOX多克隆抗体购自Abcom公司;总RNA提取试剂盒购自GIBCOBRL公司;RT-PCR试剂盒购自TaKaRa公司;PCR引物购自TaKaRa公司;DC Protein assay试剂盒购自Bio-Rad公司;硝酸纤维素膜(PVDF)购自Millipore公司,pcDNA3.1(+)连接试剂盒购自Promega公司;X-gal、IPTG、真核表达载体pcDNA3.1(+)购自Invitrogen公司;Lipofectamine2000脂质体转染试剂购自Invitrogen公司;阿霉素(ADR)购自Pharmacia公司;碘化丙啶(PI)购自Sigma公司。　　 主要仪器:温育箱、切片机、光学显微镜、高压锅、冰箱、显微照相装置、紫外/可见光光度计、低温超速离心机、组织匀浆机、超声粉碎机、转印仪、摇床、电泳仪、自动电泳凝胶成像分析仪、-70℃深冻冰箱、流式细胞仪、烤片机、荧光倒置显微镜等。　　 二、实验方法　　 1、研究膀胱移行细胞癌组织及膀胱癌细胞株中WWOX的表达情况　　 通过免疫组化、RT-PCR、Western blot方法,研究在膀胱移行细胞癌组织标本及膀胱癌细胞株T24中WWOX的表达情况。免疫组化的WWOX抗体工作浓度为1:200;Western blot方法WWOX抗体稀释比例为1:100003 RT-PCR的引物为:　　 WWOX引物序列为:　　 上游:5’-TGCTCCTTGCTGCATTGAT-3’　　 下游:5’-TGCGTATTCTACTCCCTCTGG3’　　 扩增片段大小为149bp。　　 内参照物为B-actin,序列为:　　 上游:5’-TCA CCT TCA CCG TTC CAG TTT-3’　　 下游:5’-AGT TGC GTT ACA CCC TTT CTT G-3’　　 扩增片段大小为150bp。　　 2、细胞培养　　 细胞置于37℃,饱和湿度,含5％CO2的孵箱中培养,培养液为含有10％新生小牛血清的RPMI1640,每2-3天传代一次,取对数生长期的细胞进行实验。3、真核表达载体pcDNA3.1(+)-wwOx的构建　　 通过RT-PCR方法获得WWOX全长ORF的目的片段,所得产物全长1245bp。WWOX引物序列为:上游:5’-GCCAGGTGCCTCCACAGTCAGC-3’,下游:5’-TGTGTGTGCCCATCCGCTCT-3’。将目的片段与Pmd-19-T载体进行TA克隆后,再转化感受态菌,挑选阳性克隆的菌株进行DNA测序以确定正确的菌株,常规摇菌扩增后,选取含有正确WWOX Cdna的T载体及pcDNA3.1(+)的阳性菌进行质粒提取。质粒进行测序,选择测序正确的与pcDNA3.1(+)载体进行酶切,而后进行电泳,胶回收,用酶将回收产物连接为pcDNA3.1(+)-WWOX质粒。　　 4、基因转染　　 按照Lipofectamine2000转染试剂盒说明书进行操作。转染后在含有G-418的培养液中筛选,得到稳定表达WWOX的细胞株,置于37℃,饱和湿度,含5％CO2的孵箱中培养,培养液为含有10％新生小牛血清的RPMI1640。　　 5、T24/WWOX细胞株的筛选建立与鉴定　　 T24细胞系G-418筛选试验产生阳性克隆,收集后传代扩增,命名为T24/WWOX细胞株。收集细胞进行Western blot、RT-PCR检测WWOX的表达。　　 6、克隆形成实验　　 于每个培养皿中加入10ml的含有100个细胞的培养液,使细胞分散均匀。置于37℃,5％CO2及饱和湿度条件的培养箱中静置培养。2 w后培养皿中可见克隆形成,终止培养,移除培养液,PBS均匀小心浸洗2次,纯甲醇5ml固定15 min,然后移去固定液,加适量Giemsa应用染色液染30 min后。在低倍显微镜计数大于50个细胞的克隆数。克隆形成率％=(平均克隆数/接种细胞数)×100％　　 7、MTT方法检测细胞抑制率　　 将各组细胞制成细胞悬液,调整细胞悬液浓度,加入PBS配制的ADR(12.μg/ml),37℃孵育。加入MTT溶液(即终浓度为5 mg/ml),自动酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值(A)。计算抑制率=(1——加药组A490/对照组A490)×100％。　　 8、流式细胞术检测细胞凋亡率　　 取1×106个药物处理24h的转染前后的细胞制备单细胞悬液。用PBS洗涤2次,800rpm离心5min,弃上清液,加入冰预冷的70％酒精1ml重悬,固定过夜后,以800 rpm离心5min去除固定液,PBS3ml重悬细胞,加入PI染液500μl,染色30min。350目筛网过滤,去除成团细胞。1h内FCM检测细胞凋亡率。　　 9、吖啶橙荧光染色法检测细胞凋亡率　　 各组细胞分别置37℃、5％CO2及饱和湿度条件的培养箱中静置培养使细胞贴壁。加入12.5μg/ml的ADR,PBS清洗2次,制备单细胞悬液,制备浓度为1×107个/ml。将5μl吖啶橙染液加入9μl的细胞悬液中混匀,取20μl混合液于载玻片上,盖玻片封片后置于荧光显微镜下观察。荧光显微镜所用吸收波长405nm,发射波长570nm。　　 10、统计学方法　　 采用SPSS13.0软件包进行数据处理,阳性率比较采用x2检验,计量资料以均数±标准差(-x±s)表示。组间参数采用One-way ANOVA或。Two-way ANOVA分析,如有差异,两两比较采用q检验。检验水准a=0.05,P＜0.05认有统计学意义。　　 结果：　　 1、膀胱移行细胞癌组织中WWOX表达的检测结果　　 使用免疫组化、Western blot、RT-PCR方法均检测到膀胱癌组织中WWOX表达阳性率显著低于癌旁正常组织。其中免疫组化显示WWOX蛋白的阳性表达率为20.5％(16/78),Western blot实验结果显示78例膀胱移行细胞癌组织中的18例(23.1％)为阳性,RT-PCR方法检测18例(23.1％)为阳性表达。膀胱癌组织和癌旁正常组织的阳性率比较,差异具有显著性意义(P＜0.01)。WWOX表达与膀胱移行细胞癌的组织学分级呈负相关,即癌细胞分化程度越高WWOX基因表达率越高。膀胱癌细胞株T24未见WWOX蛋白表达。　　 2、真核表达载体pcDNa3.1(+)-WWOX的构建　　 真核表达载体pcDNA3.1(+)-WWOX经酶切鉴定和基因序列分析证实序列相同,表明构建成功。　　 3、基因转染及t24/WWOX细胞株的筛选建立与鉴定　　 G-418筛选两周后,空白对照组细胞全部死亡,转染后的T24/WWOX细胞组生长良好,形态规则,以梭形、多边形居多。结果经Western Blot验证,证实存在WWOX蛋白的表达,RT-PCR也证实转染后膀胱移行上皮细胞癌细胞T24中存在WWOX的表达,说明转染成功。　　 4、克隆形成实验　　 与空白对照组和转染pcDNA3.1(+)空载体组相比,转染pcDNA3.1(+)-WWOX组的细胞克隆形成能力显著的降低了。T24/WWOX组、T24/neo组与T24组的克隆形成率分别是(22.5±6.5)％、(45.1±3.9)％和(46.6±5.6)％。T24/WWOX组与T24/neo组和T24组细胞相比,克隆形成能力明显降低(P＜0.01);T24/neo组和T24组两组之间的克隆形成能力没有显著差异(P＞0.05)。　　 5、转染WWOX对ADR诱导的细胞凋亡的影响　　 经浓度12.μg/ml的阿霉素处理后,流式细胞术检测各组细胞凋亡率,结果显示,与相应各对照组细胞相比较,阿霉素处理的细胞凋亡率均明显增加(P＜0.01),且随着药物浓度的增加,各组细胞的细胞凋亡率也明显增加(P＜0.01)。其中T24,/WWOX组的细胞凋亡率比其他两组明显增强(P＜0.01)。　　 6、MTT方法检测　　 MTT结果显示阿霉素对于三组细胞株均有增值抑制效应,生长抑制率分别为T24/WWOX组(82.5±3.8)％、T24/neo组(42.5±9.3)％和T24组(43.4±4.7)％,即转染WWOX组的细胞株比其他两组的生长抑制率明显增强,差异具有显著性意义(P＜0.01)。　　 7、吖啶橙荧光染色结果　　 在经过阿霉素处理后,荧光显微镜下可见三组细胞株均有细胞皱缩,呈现典型的凋亡形态,细胞数量减少,并且T24/WWOX组的凋亡形态学改变更加明显。　　 结论：　　 1、相对于膀胱正常组织,膀胱移行细胞癌组织的WWOX表达率明显降低,两组间的差距有显著意义;　　 2、在膀胱移行细胞癌中,WWOX的表达与膀胱移行细胞癌的组织学分级呈负相关,即癌细胞分化程度越高WWOX基因表达率越高;与临床分期、复发无明确关系;膀胱癌细胞系。T24中,未见明确的WWOX表达;　　 3、WWOX在膀胱移行细胞癌的早期发生及发展中有重要作用,可能成为诊断膀胱移行细胞癌的早期诊断指标,并可能成为膀胱癌诊断、治疗的新靶点;　　 4、通过脂质体介导的基因转染方法可以将抑癌基因WWOX高效、稳定的整合进人膀胱癌细胞株T24,建立了稳定表达WWOX的亚细胞株;　　 5、转染WWOX基因可以明显抑制膀胱癌细胞株T24的增殖,并且可诱导膀胱癌细胞株T24的凋亡;　　 6、WWOX基因转染可以增强ADR诱导的膀胱癌细胞株T24的细胞凋亡。