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全球有数百万人罹患自身免疫性疾病,然而目前临床治疗药物具有较大的毒副作用,亟需新型药物的研发。近年来,位于淋巴细胞膜上钾离子通道Kv1.3成为治疗自身免疫性疾病的新靶标。本论文对具有不同通道活性界面的蝎毒多肽与钾通道Kv1.3之间选择性相互作用展开研究,并在此基础上,探索蝎毒多肽在细胞水平和动物水平的药理学机制及生物学功能,为新型免疫抑制多肽的药用研发奠定基础。BmKTX蝎毒多肽是存在于东亚钳蝎毒液中由有三对二硫键交联而成的活性肽。我们实验室前期工作中发现它以全新的活性表面,即分子内α-螺旋和β-折叠间的结构域键合钾通道Kv1.3。具有如此独特毒素多肽-通道间相互作用的活性界面是否使BmKTX多肽成为选择性靶向Kv1.3通道的药物候选分子?这是本论文首先关注的科学问题。电生理实验表明BmKTX多肽以堵钾通道Kv1.3孔区模式阻断K+电流,而Kv1.3通道的孔区滤器附近氨基酸残基Pro372、Thr373、Asp397、Mer398以及His399等对毒素多肽键合发挥了重要作用。通道动力学结果显示Kv1.3通道的电导-电压曲线不会因BmKTX存在发生位移,说明BmKTX不影响Kv1.3钾通道的激活。BmKTX多肽对多个钾离子通道的抑制实验表明 1 nM 和 10 nM 的 BmKTX 能抑制 43.0±2.0%和 73.4± 1.6%的 Kv1.3 电流,相应的IC50值为1.0±0.3 nM;而1 μM的BmKTX仅能抑制35.4%±1.0%的 Kv1.1 电流和 20.4±1.4%的 Kv1.2 电流。另外,1 μM 的 BmKTX 对 Kv 7.1、Kv11.1、KCa2.2、KCa2.3以及KCa3.1通道电流几乎没有抑制活性。电生理实验证明了 BmKTX是一个特异性作用钾通道Kv1.3孔区的多肽抑制剂。我们进而在细胞学实验中证明BmKTX多肽不仅能够有效地抑制人T淋巴细胞系Jurkat的IL-2分泌和细胞增殖,而且也能够选择性地抑制从类风湿关节炎患者关节滑液内分离的CD3+T细胞IFN-y、TNF-α和IL-2等细胞因子分泌以及细胞增殖。在动物学实验中我们以100 μg/Kg的BmKTX多肽剂量治疗胶原诱导型关节炎大鼠,模型大鼠的各项病理指标,包括临床评分,关节肿胀程度等均有显著改善。在急性毒性实验中,50或100倍治疗剂量(5 mg/Kg或10 mg/Kg)的BmKTX多肽对小鼠没有产生明显的毒副作用,表明高剂量BmKTX多肽在动物体内具有一定的安全性。这些实验结果证明拥有独特通道活性表面的BmKTX多肽具有良好药用前景。BmKTX-D33H多肽不仅与BmKTX多肽具有截然不同的活性表面,而且作用于钾通道Kv1.3的活性(IC50值为15.4pM)比BmKTX多肽大为提高。电生理实验结果表明了 10 pM的BmKTX-D33H多肽能抑制56.0±2.0%的Kv1.3电流,而1μM的BmKTX-D33H仅能抑制46.6± 2.0%钾通道Kv1.1电流和7.2±2.4%的钾通道Kv1.2电流,同时对其它钾离子通道(包括Kv7.1,Kv11.1,KCa2.2,KCa2.3和KCa3.1)电流几乎没有抑制作用。电生理数据证明了 BmKTX-D33H多肽是钾通道Kv1.3的一个特异性多肽抑制剂。细胞学水平实验表明BmKTX-D33H多肽不仅能够有效抑制Jurkat细胞激活标记CD69的表达、IL-2分泌和细胞增殖,而且对原代CD3+T细胞的也具有显著的免疫抑制作用。在大鼠试验中,发现了 100μg/Kg剂量的BmKTX-D33H多肽能够显著地缓解迟发型超敏反应模型大鼠的耳廓肿胀程度。这些结果表明,由野生型BmKTX多肽改造的BmKTX-D33H多肽是一个特异性靶向Kv1.3通道的多肽分子,在体外、体内均具表现出良好的免疫抑制功能;实验结果也暗示了毒素多肽氨基酸残基的进化信息在设计多肽类药物中的应用。甲氨喋呤作为抗叶酸类药物应用于类风湿关节炎、银屑病、白血病等疾病的治疗中。基于甲氨喋呤独特的结构性质,我们探索了它与钾通道Kv1.3相互作用的药理学机制。电生理实验表明了甲氨喋呤能够有效抑制Kv1.3通道电流,IC50值为41.5±25.0 nM。同时,甲氨喋呤对Kv1.1通道和Kv1.2通道电流也具有一定的抑制活性。在此基础上,以人T淋巴细胞系Jurkat为模型进一步研究了甲氨喋呤作用于Kv1.3的潜在药理学效应。我们将甲氨喋呤作用于Kv1.3通道上调或下调表达的Jurkat细胞,发现甲氨喋呤诱导Jurkat细胞发生凋亡的效率也随之上升或者下降。这些实验结果进一步证实了甲氨喋呤可以通过阻断钾通道Kv1.3通道而影响Jurkat细胞的凋亡,揭示了甲氨喋呤的新药理机制,为探索甲氨喋呤在类风湿性关节炎和其它疾病治疗中的药理机制研究提供了新思路。