纤维素是生物界极其重要的一类碳水化合物,伴随着不可再生资源如煤炭、石油等的日渐枯竭,对可再生资源纤维素的降解和利用逐渐地受到人们的重视。在自然界的生物体，如细菌、真菌、动物体内，都存在纤维素酶，它是一类复合酶的统称,包括内切葡聚糖酶(Endo-1,4-β-D-glucanase),外切葡聚糖酶(Exo-1,4-β-D-glucannase)和β-葡萄糖苷酶(β-1,4-glucosidase)。其中，内切葡聚糖酶随机切割纤维素多糖链内部的β-1,4-糖苷键，通过与外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的协同作用，水解大分子纤维素为葡萄糖并最终转化成乙醇，可用于食品、纺织、造纸、饲料、中药成分提取等众多领域，在酿酒、石油开采等方面及生物能源工业都有很好的应用。然而，由于天然微生物产生的纤维素酶活力不够高,且生产成本也较高，所以通过基因工程手段来提高纤维素酶活性，已成为一个可以有效降低纤维素酶生产成本的途径。　　巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)作为甲基营养型酵母的一种，它能够在以甲醇作为唯一碳源和能源的培养基上进行生长。巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统也是一种最为常用的甲基营养型酵母表达系统，它有着优于其他表达系统的一些特点:例如它可以经外源蛋白进行翻译后修饰、其自身分泌的背景蛋白较少，糖基化程度比较低，易于增加基因拷贝数目，它对营养的要求较低，可以采用廉价的培养基进行培养,也可以进行细胞高密度发酵等。这些优点为内切葡聚糖酶的工业化生产奠定了基础，同时，作为一种在现代分子生物学研究中极其重要的模型,巴斯德毕赤酵母越来越受到研究学者的关注。　　近年来，随着微生物食品生物工程技术的不断发展，米曲霉(Aspergillus oryzae)作为发酵工业和食品加工业的重要菌种，日益成为研究热点。2005年，米曲霉RIB40(ATCC42149)的基因组测序工作由日本几家科研机构联合部分企业共同完成，该菌株是研究米曲霉生理调控的模式菌株，测序结果表明米曲霉基因组有8条染色体。米曲霉是一类产复合酶的菌株，能分泌多种酶类，如纤维素酶、蛋白酶、果胶酶、植酸酶等。本文根据NCBI数据库公布的米曲霉葡聚糖酶氨基酸序列及毕赤酵母的偏爱密码子，通过PTDS方法和结构优化合成了用于甲醇诱导型毕赤酵母表达的米曲霉葡聚糖酶(AoEGLAI)基因。　　过程如下：首先将目的基因经大肠杆菌克隆并测序，测序正确后连接到pPIC9K表达载体上，通过电击转化到毕赤酵母GS115菌株，再采用葡聚糖酶活性鉴定、SDS-PAGE鉴定等方法，最终获得米曲霉葡聚糖酶表达的阳性酵母菌株。随后将获得的毕赤酵母工程菌株进行扩大培养及诱导，获得重组葡聚糖酶，利用DNS法对其酶学性质和动力学参数展开研究。　　结果表明：重组葡聚糖酶的Km和Vmax值分别为22.47 g/L和1.22 g min-1 L-1。该酶最适pH为3.0，最适温度为50℃，在30-45℃和pH4-8范围该重组内切葡聚糖酶可保持90％以上酶活力，温度超过50℃时酶活性下降很快，70℃处理10min后其活性基本丧失，但在底物CMC存在时其热稳定性有很大的提高。重组酶混合在1mM的金属离子溶液中处理，各离子对其活性无明显影响，而10mM的金属离子Cu2+、Ca2+、Zn+、Gr3+、Fe2+和Fe3+对重组酶有激活作用，Mn2+对重组酶则起抑制作用。该酶对胃蛋白酶(pepsin)抗性相对较差，对胰蛋白酶(trypsin)则有一定的抗性。　　近年来，国内关于纤维素酶基因克隆与表达的报道已不少，但在米曲霉产内切葡聚糖酶方面的研究仍相对较少。为此，本文就来源于米曲霉的β-1,4-内切葡聚糖酶的酶学性质展开研究，本实验研究结果表明，经过改造的葡聚糖酶基因可以在毕赤酵母中高效表达，在酸性环境中其稳定性较好，为进一步探索酸性纤维素在食品工业中的应用打下了一定的基础。