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背景与目的： 死亡时间(Postmortem Interval,PMI)即从死亡发生到尸体检验的时间间隔。推断死亡时间一直是法医病理学研究的热点和难点问题,准确推断PMI对于刑事杀人案的嫌犯侦查,以及民事财产纠纷、保险理赔案件等均具有重要司法证据意义。迄今,国内外学者提出了许多死后不同阶段PMI推断的研究方法,包括利用尸体现象和尸周动植物生长周期等,以及尸体组织生物物理学、生物化学、免疫组织化学、分子生物学等技术方法,但这些方法大多存在技术手段复杂及检测指标单一、操作程序繁琐,特别是影响因素多等缺陷,因此PMI推断仍没有得到很好的解决。 基于猪的组织结构与人类的相似性,本实验以猪空肠为研究对象,应用生物力学、生物化学和量化病理学理论和技术,研究空肠组织生物力学时序性规律、组织降解规律与PMI的相关性,结合组织形态结构的量化病理学各指标之间的构效关系,探讨推断PMI的新技术手段。 材料与方法： 1、取材方法汕头屠宰场成年4月龄健康家猪,平均体重约145.5kg,屠宰后提取、分离12根空肠,置于恒温25℃/恒湿100％、白昼光照12h人工气候箱。 2、形态学观察按分组时间点,观察固定前空肠组织大体形态变化,在固定光源照度箱内,数码相机1400万像素拍照,采用Adobe Photoshop CS5软件读取RGB色值,分析RGB色值与PMI相关性。同时,留取部分组织,备制切片做常规HE染色和弹力、胶原纤维双重组合染色,采用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统,设定RGB值255条件,在显微镜400倍视野下,量化分析空肠粘膜下层面积、细胞计数、空隙面积、光密度、平均直径等指标。 3、“六定”原则规范化取材： ①定时。死后2h、14h、26h、38h、50h、62h、74h、86h、98h、110h、122h、134h共12个时间组,平均9根/组; ②定位定向。剪开系膜缘,展平肠壁,沿空肠长轴/平行粘膜皱襞纵行切取略大于长宽40mm×10mm矩形空肠组织试件,立即常规福尔马林固定; ③定液。按9:1蒸馏水/分析纯甲醛原液配制10%福尔马林固定液; ④定比。小肠质量与固定液溶剂比1:10,展平固定小肠,固定72小时; ⑤定形。取出固定组织,用电子游标卡尺测量,精确切取长宽40mm×10mm矩形试件(约<2个粘膜皱襞/试件),测量每个试件厚度,每个肠壁检材切取3个试件,生理盐水纱布保湿。同时,留取固定液兼作组织死后自溶腐败的产物萃取液,待行生物化学检测。 4、生物力学实验应用WDT-Ⅲ电子万能材料试验机,设标距25mm、20mm/min匀速纵向拉伸,上机前预调5-10次至生物力学性能稳定,同步采集极限载荷、极限载荷变形、平均力、应力、应变、厚度等指标,以及拉伸过程力-变形曲线。 5、生物化学检测快速定性滤纸过滤各时间组福尔马林固定-萃取液: ①观察并照相液体颜色变化; ②AZ8601pH计测定固定-萃取液的酸碱度; ③应用铬钴比色法检测固定-萃取液的色度; ④应用茚三酮染色法,TU-1901紫外-可见光分光光度仪扫描测定570nm处吸光度值,分析蛋白质及其降解混合物含量变化。 6、统计分析SPSS17.0统计软件进行样本t检验、单因素方差分析、多元逐步回归分析,建立回归方程。 结果： 1、大体形态变化 随着PMI延长,家猪空肠组织自溶腐败失去光泽,由淡红色逐渐变灰黄色和灰绿色,肠壁变薄、瘫软、皱襞扁平,组织结构纹理模糊、消失,臭味明显。2-14h空肠组织光泽、弹性好、抗拉力强,质实、无臭味;26-38h,组织混浊、软化、略透明、闻及臭味;50-74h组织菲薄、软化、表面污秽、透亮,臭味大;98-146h肠壁菲薄、瘫软易破、明显污秽、干枯,皱襞塌陷,气泡产生、臭味减小。 2、组织形态的显微图像量化分析 ⑴组织图像RGB取色后,各时间组色值以R、B色值最佳,R、B色值分别于14-62h和14-38h下降明显,间隔24h组间比较p<0.05,与PMI的方程分别为YR=-15.99XPMI+180.41,R2=0.9297,YB=-25.23XPMI+126.44,R2=0.9321,应为色值推断PMI窗口期。14h前以及R色值62h后、B色值38h后变化趋势均不明显,呈“S”型的前后平台期。G色值变化无统计学意义。 ⑵常规HE染色切片和弹力、胶原纤维双重组合染色的组织量化病理学观察,空肠组织面积、空隙面积等指标中,在12-108h时间段,粘膜下层胶原纤维平均直径随PMI延长,呈上升趋势,间隔24h组间比较差异性显著p<0.05,拟合方程YMD=1.0099XPMI-0.2321,R2=0.935。其他指标变化均无明显规律。 3、空肠组织生物力学性状 各时间组极限载荷(X1)、应力、平均力、厚度(X4)均总体上随PMI(YPMI)延长呈下降趋势,其中极限载荷、平均力等14-62h时间段,间隔24h比较差异显著p<0.05;应变总体组间比较P>0.05。 极限载荷/应力/平均力与厚度为自变量,与PMI因变量的相关性R分别为-0.852、-0.763、-0.828,R2分别为0.725、0.582、0.686。其中在14-62h窗口期内,极限载荷与厚度为自变量,PMI为应变量的回归方程为YPMI=143.50-6.26X1-18.16X4。 4、组织固定-萃取液检测 ⑴固定-萃取液pH值介于4.19-5.11之间,呈酸性,2-74h呈下降明显,24h组间比较差异显著p<0.05,与PMI呈线性相关,YpH=-0.1313XPMI+5.1702,R2=0.9572,为推断PMI窗口期。74-122h变化趋势不明显,呈单向后平台期曲线。 ⑵死后2-122h内,空肠组织固定-萃取液色度值随PMI延长逐渐增高,24h组间比较差异显著p<0.05,呈正相关性,拟合方程为:Y色度=2.2529XPMI+8.5293,R2=0.96。 ⑶组织固定-萃取液茚三酮染色法,2-74h内上升明显为窗口期,24h组间比较差异显著p<0.05,呈正相关性,拟合方程为YAbs=0.1416XPMI+0.1998,R2=0.9288。74-122h趋于平稳,p>0.05,呈单向后平台期曲线。 结论： 1、尸体空肠组织的自溶腐败时序性变化,乃是其降解代谢组学的尸体生物化学基础,其构成尸体组织形态学变化的物质基础,进而构成尸体组织生物力学变化的物质基础,符合构效关系的物质基本原理,可作为利用先进的物理化学技术检测相应与PMI相关的物质量变和质变的理论依据。 2、家猪空肠组织生物力学性状、固定-萃取液生物化学,以及组织形态的量化分析,呈不同的推断PMI窗口期。其中,生物化学的窗口期为死后2-122h,生物力学性状变化的窗口期为死后14-62h,组织形态像量化分析变化的窗口期为死后14-110h。 3、空肠组织固定-萃取液茚三酮染色检测适于PMI推断;空肠组织生物力学指标与PMI呈负相关,其中极限载荷为推断PMI的最佳指标;组织形态的图像量化分析法比组织形态肉眼定性观察法,更适于推断PMI,三者的优越性生物化学>生物力学>组织形态学。 4、不可控的空肠壁组织厚度的个体差异性,可影响组织生物力学性状参数,应作为一个独立的自变量因素,整合多因素相关回归分析模型。