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目的 通过导入外源胰岛素基因以补充体内胰岛素的不足,是经典的糖尿病基因治疗思路。成功的基因治疗有赖于体内治疗基因长期、有效、可调控的表达。目前,电穿孔(Electroporation,EP)作为一种有前途的体内基因导入手段,既避免了病毒载体安全性的担忧,又克服了裸质粒单纯注射转染率较低的缺点,可以实现胰岛素基因长期有效的表达。但持续的胰岛素表达势必会有低血糖的危险。所以,胰岛素基因的调控,即使其表达随血糖变化这一生理需要是基因治疗的关键问题。四环素调控系统是一种广泛应用而且安全有效的调控方法。通过给药/撤除四环素或其衍生物可启动/关闭目的基因的表达。已有应用于胰岛素基因调控的试验报道。在本实验的前期研究中发现Balb/C糖尿病小鼠裸质粒单纯肌肉注射后,血糖降低仅维持约2周。而在昆明种糖尿病小鼠的尝试中发现,一次单纯肌肉注射可以实现约7周的血糖控制。且两种系糖尿病小鼠的胰岛素表达均可实现四环素系统的体内调控。基于以上的前期探索,利用电穿孔可以增强外源基因的体内转移效率,本实验采用电穿孔介导含有人胰岛素基因的目的质粒prTA-tet4-rhINS转染昆明种糖尿病小鼠的肌肉组织,旨在探讨电穿孔增强的质粒prTA-tet4-rhINS基因治疗的可行性与安全性。方法 1.利用大肠杆菌大量扩增、提取并纯化本实验室构建的可被骨骼肌<WP=5>细胞Furin蛋白酶酶切成熟的胰岛素原表达质粒prTA-tet4-rhINS。2.以链脲佐菌素(STZ)诱导昆明小鼠成糖尿病模型。3.成模小鼠分为三组:①EP-ptetINS组(42只):为强力霉素调控的目的质粒INS(prTA-tet4-rhINS)电穿孔组,该组每只小鼠每侧后腿股部肌肉注射目的质粒INS150μg,每只小鼠共注射质粒300μg;注射后5分钟内,在注射部位两侧与注射方向平行插入两根电极针,并将其与转基因仪连接,给予方波电脉冲刺激(电压200V/cm,波宽40ms,脉冲次数6次,频率1Hz);②EP-pLNCX组(35只):为不含INS基因的空质粒pLNCX电穿孔对照组,与上组转染方法相同,但转染质粒为空质粒pLNCX;③Nake-ptetINS组(48只):为强力霉素调控的目的质粒INS(prTA-tet4-rhINS)单纯肌肉注射组。该组小鼠每侧后腿股部注射目的质粒INS150μg,每只小鼠共注射质粒300μg,注射后不予电穿孔。各组转染后立即予饮浓度为2mg/ml 强力霉素(Doxycycline, Dox)水。4.每日上午8点葡萄糖氧化酶试纸法检测鼠尾末梢血糖并秤量各组小鼠体重;ELISA检测小鼠血清真胰岛素;RT-PCR方法证实人胰岛素原基因在小鼠肌肉组织中mRNA水平上的表达;5.通过Dox给药/撤除以评价四环素系统调控人胰岛素表达的可行性。结果 1.电泳显示质粒大部分以超螺旋形式存在。2.在EP-ptetINS组与Nake-ptetINS组中,目的质粒INS采用两种方法转染肌肉组织后,均使糖尿病小鼠血糖下降,体重稳定增加,尿量减少,血清中检测到较高水平的真胰岛素,两组小鼠血清真胰岛素水平与空质粒EP-pLNCX组具有统计学差异(P<0.01)。两组降糖作用消失后,重复转染仍可达到初次注射的降糖效果,而空质粒组无效。空质粒组电穿孔后4周内死亡率达80.00%,而EP-ptetINS组仅为4.76%。3.电穿孔法转染目的质粒INS组(EP-ptetINS组)较裸质粒单纯注射组(Nake-ptetINS组)转染成功率更高(59.52% vs 12.50%,P<0.01),降糖效果更稳定(鼠间血糖标准差较小),降糖作用更持久(9周 vs 7周),真胰岛素水平略高,但无显著性差异(55.67±1.37 vs 53.33± <WP=6>2.58μIU/ml, P>0.05),且人胰岛素原基因mRNA表达程度稍强。4.对EP-ptetINS组禁食24小时后,该组小鼠血糖水平与非糖尿病小鼠无显著性差异(5.2±1.2 vs 4.9±0.2mmol/l, P>0.05), 且无低血糖发生,而空质粒EP-pLNCX组小鼠禁食24小时后,其血糖仍处于较高水平(16.1±1.2 mmol/l)。5.EP-ptetINS组电穿孔转染目的质粒INS后,立即予饮Dox水,可于第二周出现最佳降糖效果,撤除强力霉素后,该组小鼠血糖于48小时开始升高,72小时达到转染前血糖水平,再次予饮Dox水后,小鼠血糖于4天内降至撤药前水平,重复给药/撤药2次结果一致。结论 1.强力霉素调控的人胰岛素基因可以成功地转染糖尿病小鼠肌肉组织,实现较为持久的降糖作用,同时尿量减少,体重稳定增加,降低了因STZ毒性所致的糖尿病小鼠较高的死亡率。2.电穿孔介导的质粒prTA-tet4-rhINS转染较裸质粒单纯注射转染率更高,基因表达持续时间更长,表达水平更高,表达失效后重复转染同样有效,且个体差异降低,24小时禁食后,糖尿病小鼠血糖水平与非糖尿病小鼠无显著性差异,并且无低血糖发生,从而证实了它是较为安全有效的基因治疗的转染手段。3.通过给药/撤除Dox,可以实现对人胰岛素原基因表达的开关调控,为分泌蛋白的人为体内调控的可行性提供了依据。