研究背景和目的结直肠癌是常见的恶性肿瘤,据最新数据,以美国为例,2014年有71,830男性和65000女性被诊断结直肠癌,26,270名男性和24,040名女性死于结直肠癌。目前对结直肠癌的治疗以手术为主,放化疗为辅,但5年生存率仍然不高。转移是恶性肿瘤最重要的生物学特征,结直肠癌即使做了根治性手术切除,5-10年内仍有30-50%的病人出现转移,是结肠癌死亡的主要原因。然而肿瘤转移的细胞和分子基础仍未阐明,因此探讨肿瘤转移机制、早期阻断癌的转移进程并提高转移的患者的疗效,对于防治结直肠癌有十分重要的意义。免疫基因治疗作为治疗肿瘤的方法之一近年来广受关注,其作用机制主要有两个方面：1、通过各种方法增加相应的细胞因子来帮助机体消灭肿瘤细胞；2、提高肿瘤细胞的免疫原型,使其能被人体的免疫系统识别。γ-干扰素(IFN-γ)作为不可缺少的免疫性细胞因子,在人类同疾病的斗争中有重要意义,1FN-γ在人体内由T细胞和NK细胞合成,具有抗肿瘤效应和较强的免疫调节作用,可以激发和增强机体的抗肿瘤免疫应答。IFN-γ能激活NK细胞的活性,促进NK细胞发育分化,也能提高NK细胞的细胞毒活性。有研究表明,IFN-γ还可以直接抑制肿瘤细胞分裂,在肿瘤的基因治疗研究中具有一定的研究价值。IFN-γ, TNF-α,白细胞介素1/6等能诱导IRF1 (interferon regulatory factor-1)的激活,而IRF1对IFN-γ的不同的反应敏感性有着显著不同的临床预后。但肿瘤细胞对IFN-γ的不同反应是如何造成的,受IFN-γ刺激后IRF1升高程度的不同为什么能导致不同的预后,提高结直肠癌对IFN-γ的反应性是否能靶向抑制结直肠癌转移目前尚不清楚。而阐明这一现象的发生机制,可能使我们对炎症和肿瘤的复杂关系有更深层次的认识,从而发展新的结肠癌转移治疗策略,具有重要的临床应用前景和意义。微小RNA(microRNA, miRNA)是一类存在于生物体中可调控基因表达的内源性非编码小分子RNA。动物细胞中成熟miRNA均含有与靶基因mRNA的3’非翻译区(3’-UTR)碱基互补序列,即种子序列(seed sequence),成熟miRNA与靶基因的3’-UTR结合,并在Argonaute蛋白的参与下形成RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex, RISC).降解靶基因mRNA或阻止其翻译,以调控靶基因表达。KotaJ等通过腺相关病毒载体恢复肝癌细胞miR-26a的表达,使肿瘤丧失了侵袭和转移力,且无毒性反应。这一重要成果发表在Cell杂志。RossiJ为此在Cell发表评论：microRNA的多基因高效能的调控作用,具有一石二鸟之效。IFN-γ通过STAT通路激发IRF1的活性,继而结合到miR-29b的启动子序列上并促进其转录。IFN-γ诱导的IRF1依赖的miR-29b上调,导致miR-29b的靶基因IGF1的下调,IGF1在细胞的凋亡和转移中发挥重要作用,同时,在结直肠癌细胞中miR-29b也能促进IRF1的表达,因此组成了一个正反馈环,促进IRF1或miR-29b能使得结直肠癌细胞对IFN-γ更为敏感,更易发生凋亡。利用miRNA芯片从结直肠癌组织中筛选出miR-29b作为联系IFN-γ炎性因子和结直肠癌的候选miRNA,明确miR-29b在结直肠癌细胞侵袭转移和生长中的作用,主要研究内容如下：(1)验证IFN-γ及结直肠癌转移相关的miRNA;(2)明确miR-29b在IFN-γ抗肿瘤效应中的作用；(3)预测并鉴定miR-29b的靶基因,明确miR-29b在结直肠癌发生、发展的作用。本课题旨在揭示miR-29b在结直肠癌中的表达调控机制,为临床抗结直肠癌侵袭、转移提供新的miRNA和基因靶点。研究方法1. IFN-γ靶向及结直肠癌相关的miR-29b表达分析根据生物信息学和文献筛选发现在结直肠癌中表达改变的miRNAs和IFN-γ刺激后上调的miRNAs,并利用荧光定量PCR验证miR-29b的表达。利用荧光定量PCR检测41对配对结直肠癌组织中miR-29b的表达情况。2. MiR-29b受IFN-γ诱导的机制研究确定miR-29b的上游调控因子IRF1,探讨两者之间的相互调控关系,利用荧光素酶报告基因实验检测转录因子对miR-29b启动子转录活性的影响,并利用染色质免疫共沉淀(ChIP)验证两者之间的结合位点；改变细胞内转录因子的表达水平后检测miR-29b表达水平的改变。3. MiR-29b对结直肠癌细胞生物学行为的影响(1)使用慢病毒载体将anti-miR-29b转染到结直肠癌细胞HCT116和HT29细胞中,经过流式分选构建敲低miR-29b的稳定细胞株,western blot检测相关指标的变化。(2)构建miR-29b慢病毒载体,并进行病毒包装,感染结直肠癌细胞SW480及SW620,经过流式分选得到miR-29b稳定表达的细胞株,western blot检测相关蛋白的表达变化。(3)将稳定表达miR-29b和不含3’UTR的IGF1编码区载体共转染至结直肠癌细胞株SW480及SW620中,利用western blot和QPCR检测相关蛋白的表达。(4)利用CCK8、平板克隆、细胞凋亡、体外侵袭、皮下成瘤,原位种植等试验检测miR-29b抑制或过表达后对体内、体外结直肠癌细胞的增殖、侵袭能力及凋亡率的影响。4. MiR-29b的靶基因的预测及鉴定(1)以miR-29b关键词进行检索,利用数据库Targetscan、Pictar、Miranda预测miR-29b的靶基因,挑选预测后交集较多且预测值较高的靶点,双荧光素酶报告基因检测进行鉴定,并用荧光定量、western blot分别检测miR-29b和靶基因的表达,并进行相关性分析。(2)利用CCK8、平板克隆、细胞凋亡、体外侵袭等试验检测miR-29b和IGF1-CDS共表达载体转染后结直肠癌细胞增殖、侵袭能力的影响。Western blot检测相关通路蛋白的表达。5.IRF1、IGF1在结直肠癌中的相互调控(1) IRF1、IGF1在结直肠癌组织中的表达相关性分析。(2) IFN-y刺激结直肠癌细胞后,western blot检测IRF1、IGF1的表达。(3)在结直肠癌细胞中过表达转录因子IRF1,western blot检测IGF1的表达。(4)在上调或下调miR-29b的细胞株中给予IFN-y刺激,观测IRF1、IGF1表达的变化。结果1. IFN-γ靶向及结直肠癌相关miRNA的预测及miR-291)表达分析(1)通过及文献及生物信息学分析,分析IFN-y刺激下上调的miRNAs及在结直肠癌组织中有显著改变的miRNAs,通过取交集发现miR-29b在IFN-γ的刺激下显著下调,而另一组芯片数据发现,miR-29b在结直肠癌组织中的表达低于正常组织。IFN-γ过使STAT1磷酸化,进而促进IRF1入核与具有GAS结构(gamma activated sequence)的启动子序列结合,发挥相应的调控作用。(2)我们利用荧光定量PCR检测了结直肠癌5株细胞原始及收到IFN-γ(10 ng/ml,24h)刺激后中miR-29b的表达,2-△△cT值通过t检验分析结果显示：结直肠癌细胞在受到IFN-γ刺激后miR-29b均有不同程度的升高(t=-5.340, P=0.029; t=-9.911, P=0.001; t=-11.037, P<0.001; t=-4.226, P=0.013; t=-5.806, P=0.028)。 SW480和SW620细胞在IFN-γ刺激下,miR-29b在4-8小时开始升高,8-16h达到最高值。(3)利用荧光定量PCR检测了41对配对结直肠癌组织中miR-29b的表达情况。在68.3%(28/41)的配对组织中,miR-29b在肿瘤中的表达显著低于正常组织(T/N<0.5倍)。ACT值(CTmiR-29b-CTU6)通过配对t检验分析结果显示：结直肠癌组织中miR-29b也显著低于正常组织(t=-7.651,P<0.001)。进一步将miR-29b的表达与临床资料作相关性分析,低miR-29b表达与肿瘤大小(P=0.009),临床分期(P=0.014)和淋巴结转移(P=0.014)相关。2. MiR-29b受IFN-γ诱导的机制研究(1)克隆了miR-29b的启动子并且通过生物信息学(CONSIT, TFSEARCH、 MAPPER2)预测发现发现在启动子的701-712,1483-1494,1531-1542区域有IRF1的结合位点。(2)利用荧光素酶报告基因检测miR-29b启动子和转录因子IRF1之间的荧光活性,结果显示,当SW480细胞及HEK293A细胞转染IRF1-CDS质粒和PGL3-LUC质粒时,与单转染PGL3-Luc组相比,其荧光活性增强(t=-21.641 P<001; t=-5.978,P=0.004);当将IRF1与miR-29b启动子的结合位点被突变掉,荧光活性减弱,说明预测位点是有效的。(3)利用染色质共沉淀(ChIP)检测miR-29b启动子和转录因子IRF1之间的结合位点,结果显示,两者之间存在两个部位的结合,而IgG组没有发生结合。在给予IFN-y的刺激后,染色质共沉淀结果也显示,和没有刺激的细胞相比,IRF1和miR-29b的启动子发生了更多的结合。(4)通过免疫荧光实验我们发现在IFN-y刺激后,IRF1在核内表达增强(t=17.212,P=0.003),在敲低IRF1后,再次给予IFN-y刺激,结直肠癌细胞没有出现miR-29b上调(t=-2.577, P=0.062;t=-1.220, P=0.289)。(5)荧光定量PCR检测转染IRF1后,检测SW480和SW620细胞中miR-29b的表达,结果显示,两种细胞中miR-29b的表达较对照组中显著升高(P=0.026,P=0.039),提示IRF1能促进miR-29b的表达。3. MiR-29b对结直肠癌细胞生物学行为的影响(1)敲低miR-29b促进结直肠癌细胞的生长和迁移：构建稳定敲低miR-29b的HCT116和HT29细胞,采用CCK8检测miR-29b抑制后细胞的体外增殖能力的变化,并绘制生长曲线,析因方差分析结果显示：当敲低miR-29b后,HCT116和HT29细胞的增殖速度变快,HCT116细胞生长时间水平差异具有显著性(F=426.039,P<0.001),细胞增殖能力组间差异具有统计学意义(F=31.178,P<0.001)；HT29细胞生长时间水平差异具有统计学意义(F=298.909,P<0.001),细胞增殖能力组间差异具有统计学意义(F=47.907,P<0.001)。克隆形成实验显示：敲低miR-29b之后细胞平均克隆形成率升高,HCT116细胞组间差异具有显著性(t=7.399, P=0.002); HT29细胞组间差异具有统计学意义(t=-11.536,P<0.001)。划痕实验显示：敲低miR-29b之后细胞划痕愈合能力增强,HCT116细胞组间差异具有统计学意义(t=18.857, P<0.001); HT29细胞组间差异具有统计学意义(t=14.947,P<0.001)。细胞体外迁移实验：使用transwell小室检测迁移能力的改变,敲低miR-29b之后细胞侵袭能力增强,HCTI16细胞差异具有统计学意义(t=-8.682,P<0.001)；HT29细胞差异具有统计学意义(t=-4.597,P=0.008)。裸鼠皮下成瘤实验：细胞接种5只裸鼠,分别将阴性对照组和敲低miR-29b的HCT116细胞接种在裸鼠的右下、左下背侧。23天后处死裸鼠取出皮下肿瘤,均带有绿色荧光。绘制皮下瘤生长曲线,发现敲低miR-29b组皮下瘤的生长速度变快(F=88.306,P<0.001)。(2)过表达miR-29b抑制结直肠癌细胞的生长、迁移并诱导凋亡：设计并构建miR-29b慢病毒表达载体并进行慢病毒包装后转染结直肠癌SW480和SW620细胞,采用CCK8检测niR-29b过表达后细胞的体外增殖能力的变化,并绘制生长曲线,析因方差分析结果显示：当过表达miR-29b后,SW480和SW620细胞的增殖速度减弱,SW480细胞生长时间水平差异具有显著性(F=177.431,P<0.001),细胞增殖能力组间差异具有显著性(F=15.275,P=0.001)；SW620细胞生长时间水平差异具有显著性(F=214.597,P<0.001),细胞增殖能力组间差异具有显著性(F=54.326,P<0.001)。克隆形成实验显示：过表达miR-29b之后细胞平均克隆形成率下降,SW480细胞组间差异具有显著性(t=10.875, P<0.001); SW620细胞组间差异具有显著性(t=6.579,P=0.003)。裸鼠皮下成瘤实验：发现过表达miR-29b组皮下瘤的生长速度变慢(P<0.001)。细胞凋亡：使用流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示,过表达miR-29b后,SW620后,细胞的凋亡率升高。Western blot检测凋亡相关蛋白caspase-3和caspase-9的表达,在过表达miR-29b的SW480和SW620细胞株中,pro-caspase-3和pro-caspase-9蛋白表达下降,cleaved-caspase-3和cleaved-caspase-9蛋白表达升高。细胞周期：使用流式细胞仪检测细胞周期结果显示,过表达miR-29b后,SW480、SW620的周期无显著性差异。细胞体外迁移实验：使用transwell小室检测迁移能力的改变,过表达miR-29b之后细胞侵袭能力减弱,SW480细胞差异具有显著性(t=8.972, P<0.001); SW620细胞差异具有显著性(t=-6.806,P=0.006)。体内转移实验：分别将阴性对照组和过表达miR-29b的SW620细胞皮下瘤原位回种到裸鼠盲肠末端,每组接种5只裸鼠。四个处理组每组5只裸鼠。2个月后处死裸鼠,肉眼和荧光体视镜观察肿瘤转移情况,并结合病理学方法证实了大体观察情况。结果显示：对照组60%(3/5)裸鼠发生了肝脏转移和100%(5/5)发生了肠转移；过表达miR-29b组,裸鼠均未发生肝脏转移和40%(2/5)发生了肠转移,其他脏器未见肉眼可见的转移灶。4. MiR-29b的靶基因的预测及鉴定(1) miR-29b相关靶基因的生物信息学预测：在microRNA.org、TargetScan、 Pictar和miRanda四个数据库进行靶基因的预测,将4个数据库的预测结果取交集,即预测得到的可信度和准确性较高的靶基因。我们挑选出IGF1、AKAP13、YY1等mRNA做进一步的分析。(2)设计构建IGF1 3’UTR表达载体以及Mut-IGF1 3’UTR的突变载体,通过双萤光素酶报告系统检测miR-29b是否能够与IGF1 3’UTR区相结合,结果显示,在转染有IGF1基因3’UTR质粒的实验组中,单因素方差分析结果显示组间差异具有显著性(F=117.348,P<0.001),经LSD两两比较显示共转染miR-29b mimics和IGF1的3’UTR的组与其他组相比萤光素酶活性降低,且差异具有显著性(P=0.006),证明miR-29b能与IGF1基因3’UTR结合,从而抑制了萤光素酶的活性。WT+NC组与MUT+NC组相比,WT+NC组与MUT+miR-29b组相比,MUT+NC组与MUT+miR-29b组相比萤光素酶活性差异均无统计学意义(P=0.902；P=0.279；P=0.332),证明miR-29b不能与IGF1基因3’UTR突变载体结合抑制萤光素酶的活性。(3)构建了稳定敲低miR-29b的HCT116和HT29细胞,稳定过表达miR-29b的SW480和SW620细胞。WesternBlot检测转染后IGF1基因表达变化情况,观测miR-29b水平下调或后细胞通路的变化。Western Blot结果显示：敲低miR-29b的HCT116和HT29细胞IGF1的表达量增加,SW480和SW620细胞在转染了miR-29b之后IGF1的表达量下调。IGF1与位于细胞膜的IGF1-R相互作用后激活胞质蛋白如PI3K,PI3K激活后导致AKT的ser473或thr308位点磷酸化,从而激活AKT(即p-AKT),发挥生理活性。Western blot结果显示：敲低miR-29b的HCT116和HT29细胞p-PI3K、p-Akt的表达量增加,SW480和SW620细胞在转染了miR-29b之后p-PI3K、p-Akt的的表达显著下调。说明miR-29b能促进PI3K/Akt通路的活化。(4)对过表达miR-29b的SW480和SW620细胞再次转染IGF 1-CDS表达载体,从而对miR-29b的干扰IGF1表达的功能进行逆转,观测IGF1水平上调后结直肠癌细胞生物学行为的相应变化。过表达IGF1后激活PI3K/Akt通路而且在miR-29b导致的凋亡及生长转移能力下降起到重要作用。流式细胞仪分析显示在过表达miR-29b的细胞中过表达IGF1后凋亡的细胞数减少,软琼脂实验和CCK8实验显示过表达IGF1后,细胞的生长速度增快,且miR-29b导致的PI3K/Akt通路抑制也被激活了。5. IFN-γ、IRF1、IGF1在结直肠癌中的相互调控(1) IRF1、IGF1在结直肠癌中的表达的相关性分析,利用免疫组化检61对结直肠癌组织及配对的正常组织中IRF1、IGF1的表达,结果显示,IRF 1在正常组织中的表达高于癌组织中的表达(P=0.004); IGF1在正常组织中的表达低于癌组织中的表达(P<0.001),二者的表达在结直肠癌中有负相关性(r=-0.336,P<0.001).(2)在裸细胞中给与IFN-γ刺激,观察IRF1和IGF1随时间的变化。IFN-γ随着刺激时间的增加能促进IRF1的表达而抑制IGF1的表达。IGF1蛋白在8-16小时后出现下降,和前面实验中miR-29b上升的时间一致(3)在结直肠癌细胞中过表达转录因子IRF1, western blot检测IGF1的表达。结果显示,转染了IRF1-CDS质粒的结直肠癌细胞,IGF1的表达减少。(4)在12对结直肠组织中荧光定量检测miR-29b和IRF1之间的关系, spearman相关性检测结果显示他们之间存在正相关性(r=0.6467,p<0.01)。(5)在上调或下调miR-29b的细胞株中给予IFN-γ 刺激,观察IRF1、IGF1表达的变化。结果显示,过表达miR-29b也能促进IRF1的表达,而IRF1作为miR-29b的上游调控基因也能促进miR-29b的表达,IRF1与miR-29b形成正反馈并受到IFN-y的影响。IFN-y刺激下,IRF1的核内表达增强,而在敲低miR-29b的细胞中给予IFN-y刺激,IRF1的核内增强减少。而在过表达miR-29b的细胞中给予IFN-y刺激,western blot显示IRF1增强更为明显。IRF1与miR-29b形成正反馈并能将IFN-γ的作用放大,可能一定程度能促进IFN-γ更好的发挥抑癌作用。(6)分析miR-29b在IFN-γ诱导凋亡中的作用,在转染miR-29b inhibitor或对照片段的HCT116细胞中给予IFN-γ刺激,结果显示IFN-γ刺激后,在对照组细胞中,8.23%的细胞发生凋亡,而敲低miR-29b后,IFN-γ只诱导了1.22%的细胞发生凋亡。因此IRF1/miR-29b正反馈可能使结直肠癌细胞对IFN-γ更敏感。结论：1.IFN-γ促进IRF1与miR-29b的启动子结合进而促进miR-29b表达；2.低表达的miR-29b与结直肠癌的更为严重的临床分期、淋巴结转移相关；3.miR-29b抑制结直肠癌的生长、转移,促进凋亡；4.miR-29b靶向抑制IGF1并抑制PI3K/Akt信号通路；5.IRF1与miR-29b组成正反馈,在结直肠癌细胞中增强IFN-γ的凋亡诱导作用。本研究的创新之处：1.明确miR-29b与IFN-γ和结直肠癌相关：2.提出了一个新的miR-29b表达调控的机制,选题具有一定的原始创新性和研究特色；3.阐明IRF1/miR-29b/IGF1在结直肠癌侵袭和转移中的作用机制,将为肿瘤转移的诊治、预后及药物筛选提供新的靶点。