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背景及目的:脑缺血再灌注(ischemiareperfusion,I/R)损伤可导致严重的功能障碍,且临床治疗难度大。NLRP3炎性小体介导的细胞焦亡,伴随着炎症反应而发生,是脑I/R损伤的重要组成部分。文献报道,激活自噬能够抑制炎症反应,从而保护组织免受I/R损伤。本课题组的前期研究发现骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)对脑I/R损伤的保护作用可能与对自噬的调控有关。最近的研究表明,BMSCs分泌的外泌体(exosomes secreted from BMSCs,BMSC-Exos)在 BMSCs 发挥有效生物性能的机制中可能起着关键作用,BMSC-Exos不仅具有BMSCs的组织修复作用,还能规避细胞移植带来的风险。已有研究发现,在心肌I/R损伤模型中,BMSC-Exos的保护机制与通过激活自噬以缓解炎症有关。但BMSC-Exos在脑I/R损伤中的作用暂不明确。本研究旨在通过体外试验明确BMSC-Exos对脑I/R损伤的影响,并探究其机制是否与细胞焦亡和腺苷酸活化蛋白激酶(AMP activated protein kinase,AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)依赖的自噬流有关。方法:1、提取和鉴定BMSC-Exos:先采用直接贴壁法提取BMSCs,培养后收集细胞上清液,采用超高速离心法提取BMSC-Exos,使用Western blot、透射电镜和纳米颗粒跟踪分析进行鉴定。2、造模和分组:对PC12细胞进行氧糖剥夺/复氧(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)模型的建立,分为正常组、OGD/R 组、OGD/R+BMSC-Exos 组、OGD/R+MCC950 组、OGD/R+BMSC-Exos+pNLRP3 组、OGD/R+BMSC-Exos+Cq 组、OGD/R+BMSC-Exos+compound C 组。3、检测PC12细胞损伤:采用CCK-8检测细胞活性,乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)试剂盒检测 LDH 释放。4、检测PC12细胞焦亡:加入NLRP3抑制剂MCC950和转染pNLRP3过表达质粒,采用扫描电镜观察细胞形态,DCFH-DA检测活性氧(reactive oxygen species,ROS),Hoechst 33342/PI 双染色,免疫荧光和 Western blot 检测 NLRP3、cleaved caspase-1、GSDMD-N 的表达,Elisa 法检测白介素-1β(Interleukin 1β,IL-1β)含量。5、检测PC12细胞自噬流:加入自噬抑制剂Cq和AMPK抑制剂compoundC,采用透射电镜、mRFP-GFP-LC3腺病毒转染和Western blot检测自噬流,以及采用Hoechst 33342/PI 双染色,免疫荧和Western blot 检测 NLRP3、cleaved caspase-1、GSDMD-N的表达,Elisa法检测IL-1β含量检测自噬流对细胞焦亡的影响,最后通过免疫共沉淀检测NLRP3与LC3的结合互作情况。结果:1、BMSC-Exos鉴定:Western blot、透射电镜和纳米颗粒跟踪分析仪的鉴定结果均提示,提取所得的BMSC-Exos符合外泌体的特征。2、PC12细胞损伤情况:加入BMSC-Exos后,与OGD/R组对比,细胞存活率增加(p<0.05),LDH 释放减少(p<0.05)。3、PC12细胞焦亡情况:加入BMSC-Exos后,与OGD/R组对比,细胞轮廓更加明显清晰,表面绒毛增加且密集,ROS水平降低(p<0.05),Hoechst33342/PI双染色提示细胞膜更加完整(p<0.05),NLRP3、cleavedcaspase-1、GSDMD-N 的表达和IL-1β含量减少(P<0.05),上述作用与加入MCC950的作用相似,并在转染pNLRP3过表达质粒后逆转。4、PC12细胞自噬流情况:加入BMSC-Exos后,与OGD/R组对比,LC3Ⅱ/Ⅰ水平无明显变化,p-AMPK/AMPK 上升(p<0.05)、P62 和 p-mTOR/mTOR 下调(p<0.05)。加入Cq和compound C后,上述促进自噬流和抑制焦亡的作用被逆转。免疫共沉淀的结果显示,加入BMSC-Exos后,与OGD/R组对比,NLRP3与LC3的相互作用增强(p<0.05)。结论:1、BMSC-Exos可显著提高PC 12细胞存活率。2、BMSC-Exos可通过抑制NLRP3炎性小体介导的细胞焦亡,减轻OGD/R损伤。3、BMSC-Exos可通过促进AMPK依赖的自噬流通畅以抑制细胞焦亡,减轻OGD/R损伤。