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研究背景:创面愈合是外科学的基本问题之一,是贯穿整个生命周期的复杂的动态生物学过程,并且是由多种细胞、分子和细胞外基质协同作用、相互调控的组织损伤修复过程。当处置不当或伴随糖尿病等疾病时,急性创面常迁延不愈而发展成为慢性难愈创面,不仅严重影响局部外观和功能,同时大大增加了患者的经济负担。由此可见,探索能高效促进创面愈合的新材料和新策略对预防慢性难愈创面发生、促进慢性创面愈合具有重要的研究意义和巨大的社会需求。研究目的:1.探索化学条件培养MSC膜片对其来源的ECM膜片生物性能的影响;2.探索条件培养MSC膜片来源的ECM膜片对小鼠皮肤普通创面及糖尿病创面愈合的促进作用;3.探索eIF4F复合物在皮肤创面愈合过程中的作用及相关分子机制;4.探索eIF4E1及其模拟磷酸化突变体的基因治疗对小鼠糖尿病创面愈合的促进作用。研究方法:1.分离日本大耳白兔骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)制备MSC膜片,在培养基中添加LiCl和CoCl2对MSC膜片进行条件培养,培养7天后进行脱细胞处理获得细胞外基质(extracellular matrices,ECM)膜片;天狼猩红染色观察ECM膜片组织形态,扫描电子显微镜观察ECM膜片的超微结构,原子力显微镜观察其表面形貌和3-D结构,western blot检测不同组别的MSC膜片及其来源的ECM膜片中胶原和创面愈合相关生长因子的蛋白表达水平,万能拉力测试仪检测ECM膜片的抗拉强度;2.分别利用正常小鼠和糖尿病小鼠构建皮肤全层缺损模型和糖尿病皮肤创面模型,采用不同组别的ECM膜片进行治疗,正常小鼠皮肤创面分别于3天、5天和7天时取材,糖尿病小鼠皮肤创面分别于5天、7天和12天时取材,通过创面愈合面积百分比、肉芽组织厚度、再上皮化百分比、生成的血管数量、新生肉芽组织中胶原含量及与边缘正常皮肤组织整合能力评估不同组别的ECM膜片促普通及糖尿病创面愈合的效果;3.构建4EBP1、K100和eIF4E1真核表达载体,体外转染HaCaT细胞后通过western blot和细胞迁移分析阻断、抑制或促进eIF4F复合物活性对创面愈合相关因子表达和细胞迁移能力的影响;利用PluronicF-127水凝胶介导在体局部转基因,通过创面愈合面积百分比、新生的肉芽组织厚度、再上皮化百分比和生成的血管数量评估调控eIF4F复合物活性对小鼠皮肤创面愈合的影响;4.使用eIF4E1及其模拟磷酸化突变体eIF4E1D和eIF4E1E转染高糖培养条件下的HaCaT细胞,探究eIF4E1及其模拟磷酸化突变体在高糖培养条件下对创面愈合相关因子表达和细胞迁移的影响;并在此基础上比较eIF4E1及其模拟磷酸化突变体eIF4E1D和eIF4E1E基因治疗对小鼠糖尿病创面愈合的促进作用。研究结果:1.使用LiCl和CoCl2条件培养成功激活β-catenin和HIF-1α,使MSC膜片来源的ECM膜片具有更为均一的组织形态、致密的超微结构,其中单独使用CoCl2或联合LiCl获得的ECM膜片形成丰富的胶原纤维;二者联合使用时获得的ECM膜片具有更高的抗拉强度;使用LiCl和CoCl2条件培养显著上调MSC膜片中胶原蛋白和创面愈合相关生长因子的表达,提高MSC膜片来源的ECM膜片中胶原和生长因子的含量,二者联合使用作用最为显著;2.MSC膜片来源的ECM膜片能够促进小鼠皮肤创面愈合,但作用有限;使用LiCl和CoCl2条件培养MSC膜片能够提高其来源的ECM膜片促皮肤创面愈合能力;联合使用LiCl和CoCl2条件培养MSC膜片获得的ECM膜片通过促肉芽组织形成、加速再上皮化、提高血管生成及新生肉芽组织中胶原沉积等促进普通皮肤创面7天愈合,糖尿病创面12天愈合;3.过表达eIF4E1促进eIF4F复合物活性,能显著上调HaCaT细胞中创面愈合相关因子的表达并促进HaCaT细胞迁移;过表达4EBP1阻断eIF4F复合物装配、过表达K100抑制eIF4E1磷酸化,均显著下调HaCaT细胞中创面愈合相关因子的表达并抑制HaCaT细胞迁移;在体研究发现局部转染eIF4E1能显著促进小鼠普通皮肤创面愈合,而局部转染4EBP1或K100则显著抑制小鼠皮肤创面愈合;4.使用eIF4E1及其模拟磷酸化突变体eIF4E1D和eIF4E1E局部基因治疗可通过促肉芽组织形成、加速再上皮化和提高血管生成促进糖尿病小鼠皮肤创面愈合。结论:1.采用化学试剂LiCl和CoCl2条件培养MSC膜片,可显著提高MSC膜片来源的ECM膜片的生物学性能,使ECM膜片富含胶原和创面愈合相关生长因子,有效地促进普通小鼠及糖尿病小鼠皮肤创面愈合;2.使用化学条件培养MSC膜片制备了一种低成本、易储存、可有效促进创面愈合的3-D生物材料;3.通过Pluronic F-127水凝胶介导局部在体转基因证实eIF4F复合物是调控皮肤创面愈合过程的关键节点;4.通过比较eIF4E1及其模拟磷酸化突变体eIF4E1D和eIF4E1E基因治疗效果证实上调eIF4F复合物活性能显著促进小鼠糖尿病创面愈合。