研究背景“发热”与“疼痛”是临床上的常见病症,以非甾体类抗炎药（NSAID）为代表的解热镇痛剂是临床应用最多、最广泛的一类药物。但是,长期使用存在很多不良反应,如胃肠道系统损害,心血管系统损害,肝脏损害,肾脏损害,中枢神经系统的损害等。当前,以中药为代表的天然药物因其副反应少而愈来愈受到医药界的接受和重视。因此,选择中药进行解热镇痛研究开发是很有必要的。目前,对于单味天然中草药的解热镇痛研究,国内外已有大量报道,通常采用传统的溶剂提取法,如水提取法,乙醇提取法或水提醇沉法等,这种方法完全是按天然药物的研究思路进行的,未能体现中药特点。对于中药复方的研究仅限于国内报道,大都采用传统的溶剂提取法对整个复方进行提取,进而进行药效和机制的探讨。这种方法不能得到复方的最佳有效成分,达不到最佳药理药效,并且不利于其作用机理的研究。众所周知,中药复方成分组成复杂,药效机制作用不明确,传统的研究思路不能体现中药的特点。在药效导向下筛选中药高效有效部位,并在此基础上进行深入的作用机制和质量控制的研究,是一种目前研制中药新药更为有效快速的现代方法。我们即采用这种新的研究方法,根据临床疗效建立与某一病症相对应的病理模型,确定一种或多种药效作为观测与评判的指标,然后对全方及其各种提取分离部位进行活性追踪,探讨药物复方产生某种药理作用的有效部位或有效化学成分,并分析其质和量的变化与药效的关系,可在一定程度上阐明中药复方的作用机理。“退热止痛散”为我校名老中医臧堃堂教授的经验方,经过多年临床验证,其对于外感伤寒所致的上呼吸道感染引起的头痛、发热等症状,具有显著效果。但是由于该方以散剂的形式运用于临床,病人服用剂量大,口感差,服用与携带不方便,同时从卫生学角度来看也不符合规范。为此,我们选用该方进行二次开发。整个课题设计运用上述新的研究理念,首先,采用超临界CO₂流体萃取一分子蒸馏（Supercritical Fluid Extraction-Molecular Distillation,SFE-MD）联用技术,采用正交设计,以镇痛药效作为活性部位追踪指标,提取分离出该复方的活性部位。SFE的最佳工艺条件为:萃取压力25MPa;萃取温度45℃;解析压力6.7MPa;解析温度50℃;得率为3.13%;分子蒸馏最佳工艺条件为:温度70℃;真空度100Pa;刮膜蒸馏转速280-300r/min;得率为1.4%。再次,运用气相色谱-质谱（Gas chromatography-Mass spectrometry,GC-MS）联用方法对该活性部位的重要化学成分进行分析,得知其主要成分为肉桂醛（Cinnamaldehyde含量48.00%）和乙酰对氨苯乙醚（非那西汀Phenacetin4.343%）。目前,对于上述研究工作在本课题开展前已经完成。为探讨该活性部位的开发利用价值,本论文在以上研究的基础上,对该活性部位的解热镇痛药效与安全性进行了系统的初步评价,并对其相关作用机理进行了初步探讨,为下一步基于该活性部位的新药开发打下基础。本课题的完成一方面可以启动以该药活性部位为基础的一种解热镇痛新药的开发与研究,另一方面也可以为名老中医验方的“去粗取精”和二次开发提供有益参考。本研究旨在增加中药的科技含量,挖掘其疗效潜力,使其针对性增强,临床疗效进一步提高,质量标准更加安全稳定可靠,从而更好地满足患者的需要。目的基于“退热止痛散”活性部位的提取与分离,前期研究工作已经完成,本课题的研究目的主要有三个:1、对分离提取的活性部位进行解热镇痛药效学评价。2、初步探讨其解热镇痛的相关作用机理。3、对其安全性进行初步评价。方法1.1镇痛实验冰醋酸扭体法,筛选47只NIH系小鼠随机分为5组,分别为药物低、中、高剂量组,罗痛定为阳性对照组,生理盐水为空白对照组,各组小鼠分别灌胃（Intragastric administration,ig）给药（0.2ml/10g体重）,qd,连续3d。于末次给药后30min,各组腹腔注射（Intraperitoneal injection,ip）0.6%冰醋酸,记录20min内小鼠扭体次数,计算扭体反应抑制率%=（空白对照组平均扭体次数—实验组平均扭体次数）/空白对照组平均扭体次数×100%。热板法,将50只NIH系小鼠随机分为5组,分组情况同上,置于（55±0.5）℃的热板仪上,记录各组小鼠足底接触热板至出现舔后足的平均反应时间（潜伏期s）作为痛阈指标。给药前测定痛阈2次,取平均值作为基础痛阈。各组小鼠分别于ig给药（0.2ml/10g体重）后30min、60min、90min、120min各重复测定舔足潜伏期（s）,记录痛阈值。1.2解热实验筛选48只SD大鼠随机分为5组,分别为药物低、中、高剂量组,阿司匹林为阳性对照组,生理盐水为空白对照组。造模前测量体温2次,取平均值作为基础体温。ip脂多糖（Lipopolysaccharides,LPS）复制大鼠发热模型,30min后测量体温升高,发热模型建立成功。各组大鼠ig给药（2ml/100g体重）,每30min测量一次体温,连续测量3h,记录体温变化情况（△T℃）。2解热镇痛递质检测2.1小鼠镇痛标本采集和指标检测冰醋酸复制小鼠疼痛模型后,摘眼球取血,取血后立即断头取脑,分离下丘脑制备成10%的组织匀浆液,血浆和组织液分别离心,取上清。根据一氧化氮（nitric oxide,NO）试剂盒和β-内啡肽（β-endorphin,β-EP）试剂盒说明书分别进行检测。NO测量采用硝酸还原酶法;β-EP测量采用放射免疫法。2.2大鼠解热标本采集和指标检测LPS复制大鼠发热模型,在大鼠发热高峰时,眼眶后静脉取血,采血后立即断头取全脑,冰上分离下丘脑（Hypothalamus）和隔区（Ventral septal area,VSA）制备成10%的组织匀浆液,血浆和组织匀浆液分别离心,取上清;根据前列腺素E₂（Prostaglandin E₂,PGE₂）试剂盒和精氨加压素（Arginine vasopressin,AVP）试剂盒说明书分别进行检测。均采用放射免疫法测定大鼠下丘脑中的PGE₂,中枢VSA中和外周血中的AVP的含量。3安全性评价因受试药物的体积限制,预试验未能测出半数致死量(LD₅₀)。用最大给药量试验测得小鼠灌胃可承受最大给药量为30g/kg（相当于生药2143g/kg,为临床剂量的2571倍）,然后进行最大耐药量试验。将昆明小鼠40只随机分为4组,生理盐水为空白对照组,药物高、中、低剂量组,一次性ig给药,常规饲养连续观察7天,详细记录动物反应。于第8天,动物尸检,取主要脏器（心、肝、胃、肺、肾等）肉眼观察大体形态后做病理切片,进行光镜下组织形态学检查。4统计方法所有数据采用均数±标准差（（?）±s）表示,SPSS 13.0 for windows统计软件分析。采用的统计学方法有:1、完全随机设计资料,采用单向方差分析方法（one-way ANOVA）进行统计分析;方差齐同,采用LSD方法进行组间两两比较;显著性水准为α=0.05。2、重复测量数据的两因素多水平资料,采用重复测量数据的方差分析方法进行多水平比较。显著性水准为α=0.05。结果1.镇痛药效1.1 ip冰醋酸可诱发小鼠扭体反应,各试验药物组均可以减少小鼠扭体次数,组间差异有显著性（F=98.838,P=0.000）;其中3个试验药物低、中、高剂量组与均NS组两两之间比较,差异均有统计学意义（P=0.000）,提示试验药物可以减少小鼠扭体反应次数,但是3个剂量组之间未呈现剂量依赖关系。罗痛定组、低、中、高剂量组对小鼠扭体反应的抑制率分别为62.14%、58.15%、57.76%、59.86%。1.2各试验药物组给药后分别与NS组比较,均可以提高小鼠热板痛阈潜伏期（s）。主效应各时间点比较,差异有显著性（F=56.554,P=0.000）;主效应组别之间比较,差异有显著性（F=16.319,P=0.000）;各时间点与各组之间交互效应比较,也具有统计学差异（F=9.139,P=0.000）;时间点两两之间比较结果,除60min与120min之间无显著性差异（P=0.290）;其余状态之间均有统计学差异（P≤0.001）;药物均可以使小鼠舔后足的时间延长。组间两两比较结果,各给药组均与NS组比较小鼠热板痛阈值均提高,差异均有显著性（P=0.000）。结果表明,试验药物低、中、高3个剂量组均与NS组比较,在给药后30min、60min、90min、120min时均可以增加小鼠热板痛阈潜伏期（s）,延长舔后足反应时间,具有良好的镇痛效果。2.解热药效大鼠发热模型复制成功后,除NS组外,各组大鼠给药后体温均下降。主效应各时间点差异有显著性（F=19.707,P=0.000）;主效应组别间差异有显著性（F=11.374,P=0.000）;时间点与各组之间的交互效应也有统计学差异（F=2.409,P=0.003）;给药后各时间点与给药前两两比较,大鼠体温下降差异有显著性（P=0.000）;各给药组与NS组之间两两比较,药物可以降低大鼠体温差异均有显著性（P=0.000）。提示药物对LPS所致大鼠发热有解热作用,但是药物3个剂量之间没有明显的剂量依赖关系。3.疼痛递质检测3.1冰醋酸致小鼠疼痛模型后,各给药组外周血中NO的含量均降低,组间差异有显著性（F=5.417,P=0.001）。其中,罗痛定组、低剂量组和高剂量组与NS组比较,均使小鼠外周血中NO含量降低,差异有统计学意义（P＜0.01）;中剂量组与NS组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。提示试验药物可以降低小鼠外周血中NO的含量,通过减少外周致痛物质NO而达到镇痛作用。3.2各试验药物组小鼠下丘脑中β-EP的含量均增加,组间差异有显著性（F=2.679,P=0.045）。其中,罗痛定组与NS组比较β-EP的含量增加,差异有显著性（P＜0.01）;但是,药物组只有高剂量组与NS组比较β-EP的含量增高,有统计学差异（P＜0.05）。药物低、中剂量组与NS组相比,差异均无统计学意义。提示药物作用于中枢,使中枢镇痛递质β-EP的含量升高,从而达到中枢镇痛的作用。4.发热递质检测4.1各给药组均使大鼠下丘脑中的PGE₂含量降低,组间差异有显著性（F=2.749,P=0.040）。其中,阿司匹林组、药物高、中剂量组与NS组比较下丘脑中PGE₂的含量均降低,差异有统计学意义（P＜0.05）;药物低剂量组与NS组比较无统计学差异（P=0.363）。提示药物可以降低中枢负性调节介质PGE₂的含量,降低大鼠体温。4.2各给药组大鼠中枢VSA中的AVP含量均增加,组间差异有显著性（F=2.887,P=0.033）。其中,阿司匹林组与NS组比较,差异有显著性（P＜0.01）;试验药物低、中、高剂量组与NS组比较,差异有显著性（P＜0.05）。证明试验药物可以增加大鼠中枢正性调节介质AVP的含量。4.3各给药组大鼠外周血中AVP的含量均增加,组间差异有显著性（F=3.813,P=0.010）。其中,阿司匹林组与NS组比较差异有显著性（P＜0.01）;药物中、高剂量组与NS组比较,差异有显著性（P＜0.05）;而低剂量组与NS组比较,无统计学差异（P=0.383）。证明试验药物可以通过增加大鼠中枢及外周正性调节介质AVP的含量,从而达到退热作用。5.安全性评价观察给药当天,小鼠精神萎靡,活动减少,呼吸稍快,食欲不振;从第2天起至观察结束的余6天内,小鼠状态恢复,正常活跃度,体重变化均匀,正常摄食饮水,毛色光滑,无死亡现象。第8d处死小鼠,解剖肉眼观察心、肝、肾、胃、小肠等主要脏器无异常,做组织病理切片HE染色,光学显微镜下观察,各脏器组织病理无异常改变。提示小鼠的最大耐受量不小于30g/kg（相当于生药2143g/kg）,为临床用药剂量的2571倍。结论1.“退热止痛散”的活性部位具有良好的解热镇痛药效。2.镇痛机制可能是药物作用于机体后,调节镇痛中枢,增加中枢镇痛递质β-EP的含量,降低外周血中的致痛递质NO的含量,而发挥镇痛药效作用。解热机制可能是药物作用于体温调节中枢,降低正性调节递质PGE₂的含量,增加负性调节递质AVP的含量,同时增加外周AVP的含量而发挥解热药效作用。3.“退热止痛散”的活性部位安全性好,毒性很低。