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油橄榄(OleaeuropaeaL.)属木犀科(Oleaceae)木犀榄属(Olea)常绿乔木,是世界“四大木本油料植物”之一。橄榄油是唯一用油橄榄鲜果冷榨即可食用的优质食用油,油中不但单不饱和脂肪酸含量丰富,而且含有萜类化合物、多酚、黄酮等生物活性物质,具有重要的营养和经济价值。萜类化合物是油橄榄果实次生代谢产物的主要成分,其中在油橄榄果实总萜类物质中占90%左右的橄榄苦苷,具有抗菌、抗氧化、消炎等作用。高等植物萜类代谢途径主要有两种,甲羟戊酸(MVA)途径和脱氧木酮糖-5-磷酸(DXP)途径,其中3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR),可催化3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)生成甲羟戊酸,是MVA途径中第一个关键限速酶,该酶基因可调控植物萜类物质的合成,因此研究HMGR基因对于油橄榄萜类物质合成代谢途径具有重要的研究价值。本实验以油橄榄为研究对象,克隆油橄榄次生代谢产物萜类物质合成关键酶基因HMGR,得到该酶基因家族的三个基因,并对其进行生物信息学分析;为了验证该酶基因家族的功能,对三个基因均进行了原核诱导表达,并对诱导表达的重组OeHMGR蛋白进行了体外酶活验证;为了在HMGR基因转录水平上揭示该基因家族表达与油橄榄萜类物质合成积累的关系和规律,采用荧光定量PCR技术对油橄榄不同器官及果实不同发育阶段中HMGR基因的表达量进行了检测分析。主要研究结果如下:(1)分离鉴定出油橄榄HMGR基因家族的三个基因,分别命名为OeHMGR1、OeHMGR2、OeHMGR3(GenBank 登录号 KX783226、KX783227、KX783228),生物信息学分析表明:三个基因mRNAORF的长度分别为1713bp、1773 bp、1737bp,编码570、590、578个氨基酸;OeHMGR1蛋白的理论等电点(PI)为6.39,分子质量为61.42KDa,属于稳定蛋白;OeHMGR2蛋白的理论等电点(PI)为6.14,分子质量为62.31KDa,属于不稳定蛋白;OeHMGR3蛋白的理论等电点(PI)为6.38,分子质量为62.05KDa,属于不稳定蛋白;三个蛋白均具有2个跨膜区,都不含信号肽;同源序列比对分析表明,三个OeHMGR蛋白的氨基酸序列与多种植物的HMGR蛋白氨基酸序列的同源性均达到80%以上,OeHMGR编码蛋白都具有HMG-CoA结合基序(EMPIGYVQIP 和 TTEGCLVA)和 NADP(H)结合基序(DAMGMNM 和GTVGGGT);系统进化分析表明,OeHMGR蛋白均被聚类到植物HMGR群,其中OeHMGR2和OeHMGR3在同一分支,亲缘较近,而OeHMGR1单独在一个分支。因此克隆获得的三个基因均属于HMGR基因家族。(2)成功构建了原核表达载体 pET30b(+)-OeHMGR1、pET30b(+)-OeHMGR2、pET30b(+)-OeHMGR3,并将其转入到大肠杆菌BL21中成功表达,在设立的五个IPTG浓度诱导下,蛋白均能表达,在0.2mmol/L诱导下表达量最高。SDS-PAGE检测结果分析表明,3个重组酶蛋白分子量大小均在66.2～68.OkDa之间,分离纯化重组蛋白,得到纯化蛋白浓度分别为50μg/mL、98μg/mL、59μg/mL。验证重组蛋白功能,GC-MS检测到反应产物目标峰,而对照组未检测到,表明该蛋白具有3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR)催化活性功能。(3)采用荧光定量PCR检测OeHMGR在油橄榄不同组织以及果实不同生长阶段的表达量,分析OeHMGR在不同组织的表达量,结果表明该基因在组织中的表达量果实>叶>花>根,其中果实和叶中的表达量较高,而在花和根中表达量极低;分析OeHMGR在果实不同生长阶段的表达量,结果表明这三个基因在开花后45d、90d、120d表达量较低,但在花后165d表达量上升至较高水平。