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深静脉血栓形成(Deep Venous Thrombosis,DVT)是一个死亡率高、治疗过程复杂、多种因素介导、多种调控机制参与的心血管疾病,其发病机制涉及血管内皮、血液成分以及纤维蛋白溶解系统功能等诸多层面,其中深静脉内皮中IL、Argl、P-Selectin、Hmoxl、TF、Mmps等众多基因表达变化在DVT形成过程中起着重要作用。研究表明Mmps家族参与血管壁细胞外基质(ECM)的降解和重塑,这与许多血管相关生理及病理过程有联系。因此本课题旨在研究:1、在Klf15基因敲除纯合子C57BL/6小鼠深静脉内皮中,进一步验证Klf15对Mmp19表达的影响;2、探究Mmp19对小鼠深静脉血栓形成的影响。[目的]1、培育Klf15基因敲除纯合子C57BL/6小鼠,下腔静脉狭窄法构建DVT模型,旨在对比Klf15基因敲除小鼠与野生型小鼠体内深静脉血栓及血管壁组织中Mmp19表达水平的差异,进一步验证Klf15对Mmp19表达的影响。2、运用Mmp19-siRNA尾静脉注射干预小鼠Mmp19基因表达,在Klf15基因敲除纯合子C57BL/6小鼠构建上述DVT模型。通过检测小鼠静脉内皮组织中Mmp19表达变化,探究Mmp19对小鼠DVT形成的影响。[材料与方法]实验一:基因工程技术培育Klf15基因敲除纯合子C57BL/6小鼠。1.Klf15基因敲除方法Klf15基因位于C57BL/6小鼠的6号染色体上,其起始密码子“ATG”在Exon 2中,终止密码子“TGA”在Exon3中。我们选择Exon 2作为靶点,设计gRNA,通过高通量电转受精卵方式,获取Klf15基因敲出杂合子受精卵,培育小鼠,并用PCR对幼鼠进行基因分型,测序分析获得Klf15基因敲除杂合子小鼠。2.Klf15基因敲除杂合子小鼠繁育产生Klf15基因敲除纯合子小鼠1)选择性成熟(7—8周)的Klf15基因敲除杂合子小鼠与野生型小鼠进行交配。a.若F0为雄性,可以采用1:3放置野生型雌鼠长期同居法进行交配,待检查到阴道栓后取出单独饲养,再放入另一个野生型雌鼠。b.若F0为雌性,采用1:1长期同居进行交配,若5周以上仍无怀孕迹象,更换另一只野生型雄鼠。2)F1鉴定。幼鼠出生7天左右,可以采用断尾法获取组织,而后对组织采用PCR或(和)测序的方法进行鉴定,同时对仔鼠进行独立编号。有一半概率可在F1代得到Klf15基因敲除杂合子小鼠。3)行F2代纯合子繁殖:F0同染染色体与野生型交配所得后代基因型完全一致,要进行F2代纯合子繁殖,将同一只F0得到的F1雄雌间进行配笼。3.纯合子鉴定F2代小鼠繁殖成功后,再次于幼鼠出生7天左右,断趾法获取组织并对其采用PCR或(和)测序的方法进行鉴定,获取Klf15基因敲出纯合子小鼠。实验二:狭窄法构建Klf15基因敲除纯合子C57BL/6小鼠深静脉血栓形成模型,观察Mmp19对小鼠血栓形成的影响。1.实验分为两个部分:第一部分:分组共为三组(Blank组、DVT组、Klf15-KO组),选取选取6只野生型C57小鼠和3只纯合子小鼠,其中6只野生型小鼠随机分为两组,每组各3只,Blank组(野生型,n=3)、DVT组(野生型,n=3)。另选取实验一所得的Klf15基因敲除纯合子C57BL/6小鼠3只,组成Klf15-KO组(纯合子,n=3),统一SPF级动物房饲养,不限性别,体重约24-26g。将DVT组和Klf15-KO组两行下腔静脉狭窄法造模,术后24小时解剖取出血栓及形成血栓部位血管内皮组织,采用real-time PCR检测各组小鼠静脉内皮Mmp19表达变化情况并测量血栓成栓率、长度、湿重等相关指标。第二部分:选取12只Klf15基因敲除纯合子C57BL/6小鼠随机分为4组,Blank 组(A 组,n=3)、DVT-KO 组(B 组,n=3)、Mmp19-NC 组(C 组,n=3)、Mmp19-siRNA组(D组,n=3),另外随机选取体重相同的C57野生型小鼠3只为DVT-WT组(E组,n=3),其中Mmp19-siRNA组的三只小鼠,予尾静脉以Mmp19-siRNA抑制剂注射,Mmp19-NC组的三只小鼠,予尾静脉以生理盐水注射,尾静脉注射24小时后再行狭窄法DVT造模术,术后同样解剖取出血栓及形成血栓部位血管内皮组织,采用real-time PCR检测各组小鼠静脉内皮Mmp19表达变化情况并测量血栓成栓率、长度、湿重等相关指标。2.采用SPSS 22.0统计学软件分析实验数据,综合分析讨论Klf15与Mmp19的调控关系,以及Mmp19对小鼠深静脉血栓形成的影响。[结果]实验一:基因工程技术培育Klf15基因敲除纯合子C57BL/6小鼠。2018年10月25日至2019年9月13日,我们通过杂交杂合Klf15敲除小鼠共繁殖出16只Klf15敲除纯合子小鼠进行进一步实验。实验二:狭窄法构建Klf15基因敲除纯合子C57BL/6小鼠深静脉血栓形成模型,观察Mmp19对小鼠血栓形成的影响。两部分实验的麻醉效果:麻醉过程中分别予以2%浓度异氟烷麻醉剂进行诱导麻醉,以1%-1.5%浓度进行维持麻醉,空气量维持在0.3-0.5L/min,视小鼠麻醉深度在原基础上±0.5-1%逐步调整小鼠麻醉深度至满意状态。(1)第一部分实验结果①造模情况及存活情况:Blank组未造模;DVT组成功造模3只,成功率100%;Klf15-KO组成功造模3只,成功率100%。A、B、C三组均死亡率均为为0%。②成栓率:Blank组未造模;DVT组成栓2只,成栓率66.67%;Klf15-KO组成栓2只,成栓率66.67%。③各组小鼠血栓湿重、长度、湿重/长度值:Blank组小鼠未经造模,均未成栓血管组织湿重为3.07±0.77mg。DVT组、Klf15-KO组血管组织及血栓湿重分别为 12.77±1.54mg、30.35±1.65mg。与 DVT 组血栓湿重相比,Klf15-KO组血栓湿重明显增加,有统计学意义(P<0.05)。Blank组、DVT组、Klf15-KO组取材组织长度分别为 2.48±0.47mm、4.71±0.12mm、4.40±0.19mm。Blank组、DVT 组、Klf15-KO 组湿重/长度分别为 1.21±0.07、2.70±0.26、6.95 ±0.65,与DVT组的湿重/长度相比,Klf15-KO组湿重/长度比值明显增加,有统计学意义(P<0.05)。④各组小鼠下腔静脉Mmp19表达情况:与DVT组相比,Klf15-KO组Mmp19表达水平明显升高,有统计学意义(P<0.05)。(2)第二部分实验结果①尾静脉注射:C组尾静脉注射成功为2只,D组尾静脉注射成功为3只。②造模情况及存活情况:A组未造模;B、D、E三组成功造模3只;C组成功造模2只。A、B、C、D、E组死亡均为0只,死亡率均为为0%。③成栓率:A组未造模;B、C、E组均成栓2只,成栓率66.67%;D组成栓3只,成栓率100%。④各组小鼠血栓湿重、长度、湿重/长度值:A组小鼠未经造模,均未成栓血管组织湿重为0.34±0.04mg。B、C、D、E组血管组织及血栓湿重分别为3.77±0.54mg、3.35±0.48mg、1.63±0.11mg、1.87±0.44mg,与 C 组血栓湿重相比,D组血栓湿重明显减轻,有统计学意义(P<0.05)。B、C、D、E组取材组织长度分别为 4.64±0.05mm、4.48±0.11mm、4.45±0.30mm、4.63±0.10mm。B、C、D、E 组湿重/长度分别为 8.12±1.09、7.50±1.24、3.74±0.47、4.06±1.04,与C组湿重/长度相比,D组湿重/长度比值明显减轻,有统计学意义(P<0.05)。⑤各组小鼠下腔静脉Mmp19表达情况:与C组相比,D组Mmp19表达水平明显降低,有统计学意义(P<0.05)。[结论]1、Klf15可抑制小鼠Mmp19的表达。2、小鼠静脉血管内皮Mmp19可促进DVT形成。