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研究背景:中风是一种复杂且威胁生命的疾病,是全球死亡和残疾的主要原因之一。中风的恢复需要一系列神经干细胞和神经血管单元之间精密互动配合,因此在症状出现后尽快恢复缺血区血供成为缺血性中风治疗的首选,但现有治疗手段的效果都不理想,其中药物治疗是脑中风临床治疗的重要途径之一。中医学认为缺血性中风即为中风病的范涛,因经气升降失司、气血运行失常,致气血逆乱而发病,其病因病机虽然复杂,但无非气血二字;而由“气中之血药”川芎及“血中之气药”当归两味药组成的芎归方则为治疗缺血性脑血管病常用方药。本团队前期用芎归方开发的上市中成药舒脑欣滴丸进行了相关研究,表明舒脑欣滴丸有促进缺血性脑损伤大鼠血管新生、神经元再生和脑组织重建的作用。另外,现代医学研究发现干细胞具有治疗卒中的临床潜力,但也存在诸多风险;有研究表明在干细胞发挥主要治疗作用的旁分泌效应中,外泌体(exsomes)占主导地位,并且能避免干细胞治疗的诸多风险,但疗效仍有不足。此外相关研究发现,PI3K/Akt/mTOR信号通路对于促进细胞周期、细胞增殖、血管生成有着至关重要的作用。研究目的:探讨芎归方是否能对微环境进行调控,以提高骨髓间充质干细胞来源外泌体(BMSCs-exosomes)对缺血性脑卒中恢复期血管新生的作用;分析芎归方协同BMSCs-exosomes是否通过mTOR/p70S6K通路协同调控缺血性脑卒中恢复期血管新生。研究方法:1.原代大鼠BMSCs培养及鉴定。分离大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),用含1%双抗和10%胎牛血清的完全培养基培养,运用细胞流式术进行鉴定。2.BMSCs-exosomes的分离鉴定。以超速离心机100,000×g离心12小时的方法去除血清中的exosomes,配制含10%无exosomes血清的培基对BMSCs进行培养,取其上清液进行离心、超速离心以分离获得BMSCs-exosomes,并重悬于1×PBS中,-80°保存。并运用Westernblot检测法和透射电镜观察形态鉴定拍照。3.运用线栓法制作SD大鼠短暂性大脑中动脉闭塞缺血(tMCAO)模型。将实验动物随机分为六组,造模成功后的大鼠分为模型组(tMCAO组)、芎归方组(tMCAO+SNX组)、外泌体组(tMCAO+exos组)、协同组(tMCAO+SNX+exos组)、抑制剂组(tMCAO+SNX+exos+RAPA组)和假手术组(Sham组),其中芎归方组给予舒脑欣滴丸配成液(溶于生理盐水,每只大鼠按45mg/kg/d灌胃,tMCAO后24h给药并持续七天),外泌体组予以BMSCs-Exosomes400μg/kg尾静脉注射(tMCAO后24h、3d、5d、7d给药),协同组按上述方法给予舒脑欣滴丸和BMSCs-exosomes共同干预,抑制剂组则是在给予舒脑欣滴丸和BMSCs-exosomes之前先给予RAPA(每只大鼠按照2mg/kg/d腹腔注射,tMCAO后24h给药并持续七天),假手术组与模型组给予等体积1×PBS尾静脉注射。造模后第1、3和7天对大鼠进行神经功能缺损评分、足部故障测试、掉线试验。并用激光多普勒脑血流监测仪-DRT4监测大鼠tMCAO后21d脑血流量改变,于饲养21d后心脏灌注取脑,采用HE染色观察各组大鼠脑组织梗死体积。4.运用Westernblot免疫蛋白印迹法检测PI3K/Akt/mTOR/p70S6K信号通路中PI3K、Akt、mTOR、p70S6K、p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、p-p70S6K、VEGF等蛋白的表达情况。研究结果:1.各组大鼠神经功能缺损评分结果显示,缺血再灌后第3d,各组mNSS评分均有所降低,与模型组比较,协同组mNSS评分明显降低(P<0.05);与协同组组相比,外泌体组、抑制剂组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。缺血再灌后第7d,各组mNSS评分显著降低,与模型组比较,协同组mNSS评分显著降低,差异有统计学意义(P<0.05);与协同组相比,外泌体组比较差异无统计学意义(P>0.05),抑制剂组比较差异有统计学意义(P<0.05)。2.各组大鼠掉线试验显示,缺血再灌后第3d,与模型组比较,其余各组比较差异均无统计学意义(P>0.05);与协同组比较,外泌体组、抑制剂组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。缺血再灌后第7d,与模型组比较,各组比较差异均无统计学意义(P>0.05),与协同组比较,外泌体组、抑制剂组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。3.行足部障碍测试,缺血再灌后第3d,与模型组比较,其余各组评分比较差异无统计学意义(P>0.05);与协同组相比,外泌体组、抑制剂组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。缺血再灌后第7d足部障碍测试显示,与模型组相比,协同组评分显著下降(P<0.01);与协同组相比,外泌体组比较差异无统计学意义(P>0.05),抑制剂组评分明显高于协同组(P<0.05)。4.脑缺血区域脑血流量监测结果显示,与模型组相比,芎归方组、外泌体组、协同组比较差异具有统计学意义(P<0.05);与协同组相比,外泌体组比较差异无统计学意义(P>0.05),抑制剂组脑血流量较低(P<0.05)。5.脑梗死体积比较结果显示,与模型组相比,芎归方组、外泌体组、协同组比较差异均具有统计学意义(P<0.05);与协同组比较,外泌体组比较差异无统计学意义(P>0.05),抑制剂组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。6.Westernblot检测结果显示,各组间PI3K、AKT、p70S6K等蛋白表达水平差异均无统计学意义(P>0.05);与协同组相比,抑制剂组mTOR蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。与模型组相比,芎归方组p-PI3K、p-mTOR、p-p70S6K和VEGF蛋白表达水平升高(P<0.05);外泌体组p-PI3K、p-mTOR、p-p70S6K和VEGF蛋白表达水平升高(P<0.05);协同组p-PI3K、p-AKT、p-p70S6K和VEGF蛋白表达水平升高(P<0.05),p-mTOR蛋白表达水平升高(P<0.01)。与协同组相比,抑制剂组p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、p-p70S6K和VEGF蛋白表达水平显著降低(P<0.05,P<0.01);外泌体组p-AKT、p-mTOR、p-p70S6K和VEGF蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。研究结论:1.芎归方调控微环境,可能提高BMSCs-exosomes促进缺血性脑卒中恢复期血管新生的作用,改善tMCAO大鼠脑组织损伤和神经功能缺损;2.芎归方与BMSCs-exosomes可以通过PI3K/Akt/mTOR/p70S6通路协同调控tMCAO大鼠的血管新生,促进缺血性脑损伤后大鼠神经功能的修复。