论文部分内容阅读
研究目的建立硝酸甘油(NTG)型偏头痛大鼠模型,观察芎麻汤药效部位(乙酸乙酯及正丁醇提取部位)对偏头痛发作时外周血及三叉神经颈髓复合体(TCC)内CGRP、5-HT、NF-κB的影响,确定各指标与芎麻汤药效部位的相关性；及对TCC内CGRP-CRLR/RAMP1信号转导通路的干预作用,以期阐明芎麻汤药效部位治疗偏头痛的作用原理。实验方法采用不同极性有机溶剂(石油醚、乙酸乙酯、正丁醇)对芎麻汤进行梯度提取,得芎麻汤药效部位(乙酸乙酯、正丁醇提取部位混合物)。健康SD雄性大鼠96只,按体质量随机分为Ⅰ、Ⅱ两大组(Ⅰ组60只,Ⅱ组36只。各大组内包括空白对照组(KB组),模型空白组(M组),芎麻汤药效部位低、中、高剂量组(D、Z、G组),琥珀酸舒马普坦片阳性对照组(Y组)),除KB组,M组外,其余组均对应药物预处理7d后,皮下注射NTG复制偏头痛模型,造模后的第30、120min时,灌胃给药两次,观察大鼠挠头、爬笼、咬尾、往返运动等情况,判断造模成功与否；Ⅰ组大鼠均乙醚麻醉后取颈外静脉血采用ELISA检测血浆中CGRP、5-HT、NF-κB含量,心脏灌注后取全脑剥离TCC部位采用IHC染色检测CGRP、5-HT、NF-κB阳性表达；Ⅱ组大鼠均乙醚麻醉,其中18只心脏灌注后取全脑剥离TCC部位采用IHC染色检测CGRP、CRLR、RAMP1阳性表达,余18只直接取全脑剥离TCC部位并平分两份,一份组织采用Real-Time PCR检测CGRP、 CRLR、RAMP1mRNA表达,另一份组织采用Western-Blot检测CGRP.CRLR.RAMP1蛋白表达。实验结果(1)Ⅰ、Ⅱ组大鼠行为学评分比较：造模前30min内,各组大鼠行为学无显著性差异。造模后30min内,与造模前及KB组比较,各组大鼠行为学评分均明显升高(P<0.05),说明动物造模成功。给药后30min内,与同期M组比较,芎麻汤药效部位各剂量组、Y组行为学评分明显降低(P<0.05)。(2)Ⅰ组大鼠：(①血浆ELISA:与KB组比较,M组大鼠血浆中CGRP、5-HT、NF-κB浓度显著升高(P<0.01)。与M组比较,Z、G组,Y组血浆中CGRP浓度显著降低(P<0.01),D组明显降低(P<0.05)；芎麻汤药效部位各剂量组、Y组5-HT显著降低(P<0.01); NF-κB在各组之间无显著性差异(P>0.05)。②TCC部位IHC染色：SABC法检测发现,各组大鼠TCC部位均可见胞体被染成棕色的CGRP、5-HT、NF-κB阳性细胞。与KB组比较,M组大鼠TCC内CGRP免疫阳性染色平均光密度值显著升高(P<0.01);5-HT、NF-κB明显升高(P<0.05)。与M组比较,芎麻汤药效部位各剂量组、Y组TCC内CGRP免疫阳性染色平均光密度值显著降低(P<0.01)；Z、G组5-HT明显降低(P<0.05),Y组显著降低(P<0.01)；Z组NF-κB明显降低(P<0.05)。(3)Ⅱ组大鼠：①IHC染色：SABC法检测发现,各组大鼠TCC部位均可见胞体被染成棕色的CGRP、CRLR、RAMP1阳性细胞。与KB组比较,M组大鼠TCC内CGRP、CRLR、RAMP1免疫阳性细胞数显著升高(P<0.01)。与M组比较,芎麻汤药效部位各剂量组TCC内CGRP免疫阳性细胞数显著降低(P<0.01),Y组明显降低(P<0.05)：Z组CRLR显著降低(P<0.01),D、Y组明显降低(P<0.05),G组无显著性差异(P>0.05)；芎麻汤药效部位各剂量组、Y组RAMP1显著降低(P<0.01)。②mRNA表达：Rea1-Time PCR检测发现,各组大鼠TCC部位均可见CGRP、CRLR、 RAMP1mRNA的表达。与KB组比较,M组TCC内的CGRP、RAMP1mRNA的表达量明显升高(P<0.05); CRLR显著降低(P<0.01)。与M组比较,芎麻汤药效部位各剂量组TCC内CGRP mRNA的表达量均显著降低(P<0.01),Y组明显降低(P<0.05)；G组CRLR显著升高(P<0.01)；D、Y组RAMP1显著降低(P<0.01),Z、G组明显降低(P<0.05)。③蛋白表达：SDS-PAGE凝胶电泳检测发现,各组大鼠TCC内均可见CGRP、CRLR、RAMP1蛋白表达,且在各组之间存在明显差异。与KB组比较,M组TCC内CGRP蛋白表达下降；CRLR、RAMP1明显下降。与M组比较,芎麻汤药效部位各剂量组TCC内CGRP蛋白表达明显下降；Z、G组CRLR蛋白表达明显升高；芎麻汤药效部位各剂量组RAMP1蛋白表达明显升高。最终结论(1)芎麻汤药效部位降低NTG型偏头痛大鼠外周血中CGRP、5-HT浓度,从而改善偏头痛发作时血管活性物质和神经递质水平失常达到缓解偏头痛症状。(2)芎麻汤药效部位下调NTG型偏头痛大鼠TCC内CGRP、5-HT、NF-κB表达,从而改善偏头痛发作时三叉神经血管系统激活后引起的神经源性炎症反应,达到缓解偏头痛症状。但与芎麻汤药效部位治疗偏头痛相关性最强的指标为CGRP。(3)芎麻汤药效部位通过降低NTG型偏头痛大鼠TCC内CGRP、CRLR、RAMP1免疫阳性细胞数和下调CGRP、RAMP1mRNA表达来下降偏头痛发作时三叉神经血管系统激活后RAMP1过表达引起的三叉神经节对CGRP高度敏感现象,通过下调CGRP蛋白表达,上调CRLR、RAMP1蛋白表达,进一步导致CGRP释放减少、表达下降,干扰CGRP的正负反馈回路,最终实现治疗偏头痛的作用原理。