质粒介导的多黏菌素抗性基因mcr-1在多药耐药肠杆菌科细菌中的发现,迅速引起全球各个国家政府和科学家的高度关注,这导致多黏菌素作为治疗严重耐药革兰氏阴性肠杆菌感染的“最后防线”作用极大降低。因此,临床上急需解决携带mcr-1基因的多药耐药菌感染问题。本研究旨在通过实验室建立的MCR-1耐药酶抑制剂筛选平台筛选出一种MCR-1活性抑制剂以恢复多黏菌素对多药耐药肠杆菌科细菌的抗菌活性,并成功筛选获得天然化合物和厚朴酚,其作为MCR-1的活性抑制剂可显著恢复多黏菌素类抗生素的体内外抗菌活性。通过棋盘法MIC试验发现和厚朴酚浓度在16μg/mL时可显著恢复多黏菌素对MCR-1阳性大肠杆菌、沙门氏菌以及肺炎克雷伯的抑菌作用,当和厚朴酚的浓度≥16μg/mL时,其最小抑菌浓度试验的分级抑菌浓度指数FICI均小于0.5(0.09±0.00至0.27±0.06)。此外,和厚朴酚与多黏菌素在MCR-1阴性耐多黏菌素革兰氏阴性肠杆菌科菌株中也具有显著的协同作用。通过生长曲线试验验证了和厚朴酚在使用浓度条件下对MCR-1阳性肠杆菌菌株的生长无显著影响。通过细胞毒性试验发现,和厚朴酚浓度低于32μg/mL时,与MH-S细胞共孵育24小时后无显著的细胞毒性作用。进一步通过时间-杀菌曲线试验和抑菌环检测试验确证了和厚朴酚能够明显恢复多黏菌素的杀菌活性。本研究通过Western-blot检测和分子动力学模拟试验进一步确证和厚朴酚对MCR-1的抑制作用机制。Western-blot检测结果显示,和厚朴酚与MCR-1阳性菌共培养4-6小时后,对MCR-1的表达无显著影响。分子动力学模拟结果表明,和厚朴酚直接结合至MCR-1活性区域,进而影响了MCR-1与底物的特异性结合,导致其转移磷酸乙醇胺的活性被抑制。本研究通过建立三种不同的小鼠感染模型确定和厚朴酚是否可提高多黏菌素对试验小鼠的保护作用。小鼠全身感染模型试验结果发现,与单独多黏菌素治疗相比,和厚朴酚可提高多黏菌素对试验小鼠40%的保护率;在小鼠大腿肌肉感染模型中,和厚朴酚联合多黏菌素可显著减少试验小鼠大腿肌肉的细菌定植数;在小鼠肺炎模型中,联合疗法能够明显减轻小鼠肺部病理损伤。本研究进一步探索了从天然化合物厚朴中提取和纯化和厚朴酚的工艺研究,通过建立的提取工艺最终获得了较为理想的和厚朴酚提取物。通过对提取物抑制MCR-1的活性进行检测,结果表明和厚朴酚提取物与多黏菌素同样具有显著的协同效果。综上所述,本研究通过体内外试验确定了和厚朴酚作为MCR-1活性抑制剂可显著提高多黏菌素类抗生素的抗菌活性,通过建立了完整的和厚朴酚提取工艺,为和厚朴酚后期大规模应用于临床上治疗严重的革兰氏阴性菌感染提供了原料保障。