全氟异丁烯(Perfluoroisobutylene,PFIB)是一种有机氟工业生产中的气态副产物,剧毒,它能够穿透普通防毒面具的防护而损伤人体。其毒性是光气的10倍,即使少量吸入就可引起急性肺损伤(Acute Lung Injury,ALI)的发生,严重者可以发展成急性呼吸窘迫综合征致其死亡。PFIB引起的吸入性肺损伤,起病急骤,主要的临床特征为渐进性呼吸困难及难治性低氧血症。由于目前对PFIB所致ALI的致病机理尚不完全清楚,致使缺乏行之有效的治疗手段及医学防护措施。国内外实验室及本课题组的先期研究发现:PFIB引起的ALI主要是中性粒细胞(Polymorphonuclear neutrophil,PMN)活化所致的过度炎症反应的结果。但是临床上单纯使用激素冲击性抗炎治疗,效果并不显著,死亡率仍然较高。自噬(autophagy)是真核细胞独有的一种利用溶酶体降解细胞内物质的过程。它具有两方面的作用:一方面可以降解细胞质中破碎的细胞器及过多或者变性的大分子物质,为细胞及蛋白质的合成提供能量及养料;另一方面它的过度活跃或者低下则有可能对细胞造成不利影响甚至破坏。近年来研究发现自噬过程与多种肺部疾病如急性肺损伤、肺动脉高压、肺部感染、慢性阻塞性肺疾病、特发性肺纤维化等的发生发展密切相关。自噬的“双刃剑”作用,使它在不同细胞乃至不同类型肺损伤中的作用也不完全相同。本实验的目的是了解PFIB吸入性肺损伤中肺组织是否有自噬活动的变化,揭示自噬的活动规律,探究自噬在PFIB所致ALI中的作用,为PFIB吸入性肺损伤的医学防治和寻找治疗靶标提供参考。首先将42只SPF级Wistar雄性大鼠(8周龄,180-200 g)随机分为7组(n=6)。根据本课题组先期研究的PFIB所致的吸入性肺损伤动物模型制备方法,对6个染毒组大鼠进行全身暴露动态吸入PFIB染毒(PFIB浓度290 mg/m3,染毒时间8 min),正常对照组在过滤空气下暴露8 min。分别于暴露后的1 h、2 h、4 h、8h、16 h及24 h 6个时间点对42只大鼠麻醉处死,并收集大鼠肺组织和支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)等样本。通过测定大鼠肺系数(肺湿干比、肺含水量、肺湿体比、肺干体比)、BALF中总蛋白含量,并进行肺组织病理学检查。然后通过透射电镜观察肺组织中自噬体的变化情况,蛋白免疫印迹法(Western blot)测定微管相关蛋白轻链3(LC3)的表达变化情况。结果发现:大鼠在PFIB染毒后16 h及24 h的肺系数和BALF中总蛋白含量显著升高,发生急性肺间质与肺泡水肿伴大量PMN渗出。对比本课题组以往的实验结果,证实本次实验的大鼠PFIB所致的ALI模型复制成功。在正常对照组以及PFIB染毒后1 h、2 h、4 h、8 h5个组中的Ⅰ型及Ⅱ型肺泡上皮细胞中均可见自噬体,且以染毒后1 h易见。PFIB染毒后1 h LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值显著升高,之后持续下降,24 h降至基础水平。以上实验结果提示,PFIB所致的ALI中伴有自噬活动的变化,存在消长现象。基于以上结果,我们进一步采用常用的自噬工具药——自噬诱导剂雷帕霉素(rapamycin,RAPA)和自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)——来干预大鼠细胞自噬水平,观察对大鼠PFIB所致的ALI的影响。进一步探究自噬在PFIB所致的ALI中的作用。在3-MA抑制自噬的实验中,48只SPF级雄性大鼠(8周龄,180-200 g)随机分为8组(n=6),分别为溶剂对照1 h组、给药对照1 h组、溶剂染毒1 h组、给药染毒1 h组、溶剂对照8 h组、给药对照8 h组、溶剂染毒8 h组和给药染毒8 h组。其中4个给药组动物在染毒或空气暴露前30 min腹腔注射3-MA一次,剂量为30 mg/kg bw。4个溶剂组动物参照相应的给药方式及体积给予生理盐水。对4个染毒组大鼠进行全身暴露动态吸入PFIB染毒(PFIB浓度290 mg/m3,染毒时间8 min),4个对照组在过滤空气环境下暴露8 min。暴露后,分别于1 h、8 h 2个时间点对8组大鼠进行麻醉处死,收集肺组织及BALF。测定大鼠的肺湿干比(W/D)和BALF中的总蛋白含量,并进行肺组织病理学检查以及Western blot测定肺组织中的LC3的表达水平。结果发现,染毒后1 h各指标变化情况如下:1)给药对照组和给药染毒组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值均显著低于相应的溶剂对照组和溶剂染毒组,提示肺组织的自噬受到显著抑制;2)BALF中的总蛋白含量各组间无明显差异;3)溶剂染毒组与给药染毒组较较相应对照组的W/D比值均显著升高,但两组染毒组间无明显差异,提示PFIB染毒后1 h肺组织出现了明显肺水肿,但干预自噬对肺水肿没有明显影响。在染毒后8 h,1)两个给药组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值与相应的溶剂组比较仍有下降的趋势,但是无统计学意义,提示3-MA对肺组织细胞自噬仍有一定抑制作用;2)给药染毒组的W/D明显低于溶剂染毒组,但高于给药对照组,溶剂染毒组显著高于溶剂对照组;3)BALF中的总蛋白含量结果中,溶剂染毒组和给药染毒组均明显高于相应对照组,给药染毒组与溶剂染毒组比较有下降趋势,但没有统计学意义;4)从肺组织病理学检查中看出,给药染毒组较溶剂染毒组的肺组织血管周围水肿程度及炎性细胞渗出有所减轻。以上结果提示3-MA抑制自噬作用明显,在PFIB急性吸入性肺损伤早期(染毒后1 h)保护作用不明显,但在后期(染毒后8 h)对PFIB所致的肺损伤具有一定的保护作用。在RAPA诱导自噬的药物干预实验中,48只SPF级雄性大鼠(8周龄,180-200g)同样随机分为8组(n=6),分别为溶剂对照1 h组、给药对照1 h组、溶剂染毒1 h组、给药染毒1 h组、溶剂对照8 h组、给药对照8 h组、溶剂染毒8 h组、给药染毒8 h组。给药组的给药方式:从染毒前的第5天开始,按10 mg/kg bw腹腔注射RAPA,每天一次,第5天给药时间为染毒前30 min。4个溶剂组参照对应的给药方式及体积给予溶剂。染毒方式、取材时间及实验方法与3-MA实验相同。应用酶联接免疫吸附法(ELISA)测定BALF中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量。结果表明:1)染毒后1 h,给药染毒组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值显著高于溶剂染毒组,给药染毒组也显著高于给药对照组,溶剂染毒组也显著高于溶剂对照组,说明RAPA能明显诱导自噬,同时也再次验证了PFIB染毒后自噬活动明显增强;2)染毒后1 h的W/D、BALF中的总蛋白含量及病理学检查和ELISA的结果,各组间均没有明显变化,提示此时肺组织损伤作用不明显;3)在染毒后8 h,给药染毒组和给药对照组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值仍显著高于相应的溶剂染毒组和溶剂对照组,表明在染毒后8 h RAPA对自噬的诱导作用仍十分明显;4)染毒后8h给药染毒组的W/D比值显著低于溶剂染毒组,给药染毒组的BALF中总蛋白含量也显著低于溶剂染毒组;组织病理学检查显示给药染毒组相较于溶剂染毒组肺水肿较轻,PMN及AM渗出较少。5)PFIB染毒后8 h的大鼠BALF中IL-1β、IL-6、TNF-α含量有不同程度的增高,以IL-1β升高最为显著;给药染毒8 h组较溶剂染毒8 h组的炎性因子含量显著性降低,以IL-1β、TNF-α为著。以上结果表明染毒后8 h给药染毒组的肺损伤程度比溶剂染毒组轻,提示RAPA对肺组织具有保护效应。总结以上的实验结果:1)PFIB所致的ALI中伴有自噬活动的变化,存在消长现象。在起病初期(1 h),Ⅰ型及Ⅱ型肺泡上皮细胞中自噬活动活跃,并在24 h内降至基础水平。2)自噬对PFIB所致的肺损伤具有促进作用。RAPA及3-MA均能对PFIB所致的ALI具有一定的保护作用。这可能因为自噬对PFIB所致的肺损伤具有促进作用,3-MA通过抑制细胞自噬而发挥对PFIB急性吸入性肺损伤的保护效应;而RAPA则因为兼具抗炎作用,并且因其抗炎作用而带来的对肺组织的保护作用超过了因其诱导自噬而对肺组织的损伤作用,从而减轻PFIB急性吸入性肺损伤。本课题对PFIB所致的ALI提供了新认识,为医学防治提供了参考意见。