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乳酸菌作为食品工业和人体肠道中重要的微生物,易受到环境变化的影响,而生物膜的存在可有效提高乳酸菌抗逆性。但是群体感应系统调控其生物膜形成的机制尚不明确。本研究通过筛选具有较高成膜特性的有益乳酸菌并进行鉴定,同时以菌株不同生长状态为基础,分析其对不良环境的耐受性及产信号分子AI-2的能力,探讨菌株抗逆性与信号分子AI-2之间的关系;然后基于全基因组数据分析对信号分子AI-2关键基因luxS进行敲除,并利用转录组学与蛋白质组学技术明确LuxS/AI-2群体感应系统对乳酸菌生物膜形成的作用机制。本研究主要得出以下结论:以分离自西藏牦牛乳制品和锡盟酸马奶乳制品中的241株乳酸菌为研究对象,以菌株耐pH3.0、低浓度胆盐0.05%的能力为评价指标进行初筛,筛选出对两种环境均有较强耐受性和活力较好的乳酸菌64株。采用结晶紫染色法对64株乳酸菌生物膜形成能力进行测定,从中筛选出25株高产生物膜乳酸菌。人工胃肠液耐受试验结果显示,有17株乳酸菌分别在模拟胃肠液中培养3 h后都有相对较高的存活率,其中菌株TG5-1-4、TZ3-1-8和RM1-1-7可以在模拟肠液中生长;有害代谢产物试验结果显示,有15株乳酸菌有害代谢产物评价结果均为阴性;对25株高产生物膜乳酸菌的信号分子AI-2分泌能力进行测定,仅有4株乳酸菌高产信号分子AI-2,经鉴定4株乳酸菌分别为Lactobacillus plantarum RM3-1-3、Enterococcus faecium TZ2-1-1、Lactobacillus fermentum 733和Pediococcus acidilactici 132。以4株耐酸、耐胆盐、产信号分子AI-2能力强且具有较高成膜特性的有益乳酸菌L.plantarum RM3-1-3、E.faecium TZ2-1-1、L.fermentum 733和P.acidilactici 132为研究对象,通过制备浮游态与被膜态菌株,分别研究其对不同胁迫环境的耐受性,并对菌株在逆境下产信号分子AI-2能力进行测定,结果表明:不同胁迫条件下,菌株活菌数均会受到抑制,但是被膜态菌株表现出较好活性;而环境胁迫对信号分子AI-2活性影响较大。酸胁迫时,信号分子AI-2活性变化规律不尽相同,但是当pH值为4.5时,除L.plantarum RM3-1-3外,被膜态E.faecium TZ2-1-1、L.fermentum 733和P.acidilactici 132信号分子AI-2分泌量达到最大值。胆盐胁迫时,随着胆盐浓度的增加,信号分子AI-2活性呈下降趋势,但在高浓度胆盐环境,大部分浮游态菌株表现出信号分子AI-2活性高于被膜态。温度胁迫时,当培养温度为4、10、55和70℃时,乳酸菌几乎不产生信号分子AI-2;当培养温度为45℃时,除L.fermentum733外,其余3株乳酸菌信号分子AI-2分泌量低于对照组37℃且浮游态菌株分泌信号分子能力更强。盐胁迫时,信号分子AI-2活性整体随Na Cl浓度的增加而减少,但Na Cl浓度高于4.5%时,严重抑制AI-2分泌。冷冻胁迫对乳酸菌信号分子AI-2活性的影响存在菌株特异性。以对不良环境抗性较好且信号分子AI-2活性较高的具有高成膜特性的有益L.fermentum 733为研究对象,通过对其全基因组测序数据分析,定位了调控群体感应关键基因orf01877,该基因是编码LuxS蛋白合成的关键基因,因此对L.fermentum733信号分子AI-2合成关键基因luxS进行敲除;利用λRed基因重组技术成功构建luxS基因缺陷株,并对L.fermentum 733敲除条件进行优化,得到最佳电转条件为:在菌株培养时加入0.7 mol/L Na Cl培养至对数中期制备感受态,电转时质粒添加量为2μL、电压为1.8 KV、抗生素浓度为2.5μg/mL、L-阿拉伯糖浓度为100 mmol/L,转化效率最高;基于傅里叶红外光谱和细胞生理学试验得出:敲除luxS基因会显著降低L.fermentum 733生物膜生成量,同时降低对酸、胆盐、高温和高渗环境的抗逆性。而生物膜生成量的减少,主要由于luxS基因的缺失,导致生物膜中不饱和脂肪酸、EPS、蛋白质和e DNA含量和生物膜的流动性显著降低;经相关性分析得出,敲除前后蛋白质是生物膜形成的最主要影响因素。利用转录组学与蛋白质组学相结合的手段,分析luxS基因缺失对L.fermentum733生物膜形成的影响,结果显示,luxS基因的缺失,影响了信号分子AI-2的合成,导致wecB编码的mRNA和蛋白下调表达,减少EPS合成量;同时会限制L-同型半胱氨酸的合成量,影响L-半胱氨酸的合成,导致其编码metC基因的mRNA和蛋白表达量减少,进而限制半胱氨酸向丙酮酸的分解。而丙酮酸生成量的减少,主要会通过以下三个途径影响生物膜的形成:首先丙酮酸还原乳酸过程中,会产生大量ATP,而luxS基因的下调,显著下调nrdD基因编码的mRNA和蛋白的表达量,使ATP合成量降低,进而降低了dATP和dGTP的合成量,导致e DNA合成量减少。其次,ATP合成量降低,使ATP依赖型基因idhl编码的mRNA和蛋白表达量下调,使下游产物酮戊二酸积累量减少,由于合成原料缺失影响了精氨酸的合成,从而导致Arg家族mRNA和蛋白的表达量显著下调,进而阻碍了胞外蛋白的合成;最后,丙酮酸合成量的减少导致乙酰辅酶A合成受阻,影响了生物膜脂肪酸的合成和代谢,同时Acc和Fab家族的mRNA和蛋白质下调表达,抑制了脂肪酸碳链的延长和不饱和脂肪酸的合成,导致生物膜流动性变差。综上所述,LuxS/AI-2群体感应系统通过信号分子AI-2调控生物膜中主要组分含量来影响L.fermentum 733生物膜的形成,进而影响菌株对不良环境的抗逆性。这一发现为后期定向调控乳酸菌生物膜形成并改变其抗逆性提供理论依据。