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长臀鮠是东亚特有种,该种只分布于中国南部,国外仅见于越南北部的红河水系,现在野外群体数量日益减少。本文利用AFLP和微卫星分子标记技术对珠江长臀鮠和海南长臀鮠的遗传结构和分类地位进行了研究,并建立了长臀鮠的AFLP标记的分析体系。探讨了珠江长臀鮠和海南长臀鮠的遗传进化和亲缘关系,以此为长臀鮠的鉴定和遗传背景以及长臀鮠的种质保护提供分子水平上的依据。
1.长臀鮠AFLP标记分析体系的建立和AFLP标记分析以珠江长臀鮠为试验材料,建立了长臀鮠扩增酶切片段长度多态性(AFLP)分析体系,对其分析过程中的DNA提取、双酶切、单酶切、连接、预扩增、选择性扩增、银染等步骤进行了检测,并对反应条件进行了优化。研究结果表明:长臀鮠AFLP分析体系中,最佳的提取基因组DNA方法是利用试剂盒提取;单酶切不适合用于长臀鮠AFLP分析体系;双酶切组合Pst Ⅰ/Taq Ⅰ、EcoR Ⅰ/Mse Ⅰ在长臀鮠群体中均能得到清晰的、高多态性的长臀鮠AFLP指纹图谱;T4连接的最佳用量是2 U,最佳反应温度为37℃;在图谱条带的检出方法中,证实了银染的有效性,并确立了最佳的银染流程;在长臀鮠AFLP的预扩增、选择性扩增分析中,试验并建立了预扩增和选择性扩增反应体系。利用已建立的长臀鮠AFLP分析体系,采用Pst Ⅰ/Taq Ⅰ、EcoRⅠ/Mse Ⅰ等2组双酶切组合构建了长臀鮠的AFLP指纹,条带清晰可辨,扩增信号强,得到清晰的、高多态性的长臀鮠AFLP图谱。
研究采用AFLP分子标记技术对珠江长臀鮠和海南长臀鮠群体共60个个体(每个群体30个)进行了遗传多样性、遗传分化及亲缘关系研究。选取的18对引物组合均能扩增出清晰、可重复的扩增产物,扩增带型差异明显,其中Pst Ⅰ/TaqⅠ酶切组合引物10对,EcoR Ⅰ/Mse Ⅰ酶切组合引物8对。珠江长臀鮠和海南长臀鮠群体均体现出较高的多态位点比例和特异性条带数。在珠江长臀鮠中18对引物共检测出885条不同的扩增片段,平均每对扩增49.17条。其中301个座位是多态性的,平均为16.72条,多态性座位所占比例为34.01%,18对引物共扩增出22条特异性条带,平均每对引物扩增出1.22条特异性条带。在海南长臀鮠中18对引物共检测出881条不同的扩增片段,平均每对引物扩增48.94条,其中304个座位是多态性的,平均每对引物为16.89条,多态性座位所占比例为34.51%,18对引物共扩增出28条特异性条带,平均每对引物扩增出1.56条特异性条带。群体内个体间的遗传相似度(平均值)珠江长臀鮠种群为0.9462±0.0237,海南长臀鮠为0.9465±0.0226,两者近似相等,海南长臀鮠比珠江长臀鮠略高。群体间的遗传相似度是0.9367±0.0231,小于两个群体内的遗传相似度,两群体的遗传距离是0.0634±0.0230。根据遗传相似度绘制了UPGMA聚类图。珠江长臀鮠群体和海南长臀鮠群体都分别先各自聚成一支,再聚合到一起,Pst Ⅰ/Taq Ⅰ、EcoRⅠ/Mse Ⅰ两种酶切组合的聚类最终结果一致。
研究结果表明:珠江长臀鮠和海南长臀鮠间的遗传分化不大,两者间的遗传差异属于种内差异,长臀鮠科、长臀鮠属只有一个有效种。
2.长臀鮠的微卫星位点筛选和群体遗传多样性分析利用大口鲶和鲤科鱼类微卫星引物在长臀鮠中进行扩增,结果在55对引物中,23对引物能成功扩增,且在长臀鮠中的扩增产物表现稳定。其中13对有多态性,等位基因数在2-4个之间,平均等位基因数2.92±0.08个;扩增的条带符合孟德尔遗传规律。随后利用筛选的微卫星座位对珠江长臀鮠和海南长臀鮠群体遗传多样性进行分析。分析显示:珠江长臀鮠的平均观测杂合度(Ho)是0.38±0.3,平均期望杂合度(He)是0.47±0.1:群体座位平均多态信息含量(PIC)为0.387±0.18;海南长臀鮠的平均观测杂合度(Ho)和平均期望杂合度(He)分别是0.4±0.19、0.44±0.2:两群体间的遗传相似度为0.886、遗传距离为0.121。13对微卫星引物在两个群体中共检测到5条特异性条带,珠江长臀鮠和海南长臀鮠均有特异性微卫星位点可用于鉴定。实验比较AFLP和微卫星分子标记在长臀鮠遗传结构研究中的效度。
研究结果表明:用其他鱼类的微卫星引物可以快速筛选到长臀鮠群体微卫星分析的座位。珠江长臀鮠和海南长臀鮠间的遗传分化不大,两者间的遗传差异属于种内差异,长臀鮠科、长臀鮠属只有一个有效种。长臀鮠的种质资源处于相对比较好的状态。两种分子标记AFLP和微卫星均适用于长臀鮠遗传结构研究,但两者存在一定的差异。