目的:年龄是心力衰竭（HF）的主要危险因素。50岁以上的人群中大约有1%会受到HF的影响,而在75岁以上的人群中HF的患病率达8.4%。因此,HF已成为老年人死亡的主要原因。心肌衰老具有独特的组织学和生化特征,表现为左室心肌肥厚,心肌细胞数量的减少,心肌线粒体功能异常,心肌细胞的体积增加,脂质积累和纤维化区域的增加。纤维化是各种慢性疾病和衰老相关器官功能衰竭的发病机制,是心肌病理重塑的最后标志。组织纤维化的发生与衰老密切相关,而衰老是组织纤维化进展的触发和诱发因素。衰老心肌细胞通过凋亡和/或坏死途径丢失,导致剩余的心肌细胞肥大和纤维化。纤维化使心肌组织变硬且顺应性较差,随后导致心脏收缩功能障碍,增加了HF的风险。研究表明,高龄会激活Wnt/β-catenin信号,促进不同组织中产生衰老相关的表型,并诱导心肌纤维化基因的表达。GSK-3β破坏了β-catenin的稳定性在Wnt/β-catenin信号通路的调节中起着关键作用。因此,减少心肌纤维化的发生是治疗心力衰竭的靶点,负调控心肌纤维化所涉及的内源性途径对于抑制心脏衰老至关重要。Nur77（也称为NR4A1,NGFI-B）是一种转录因子,属于孤儿核受体Nr4A家族,受NGF刺激而表达上调。Nur77已被证明在多种组织中广泛表达,并参与调节不同的生物学及生理学进程,如能量代谢,细胞周期,细胞凋亡,炎症等。研究表明,Nur77敲减会导致新生大鼠心肌细胞肥大,此外,Nur77可以抑制慢性β-肾上腺素刺激,慢性ISO刺激引起的不良心脏重塑,而在小鼠心肌内注射Nur77腺病毒可减少慢性ISO输注引起的心肌肥大,纤维化并改善射血分数。并且,Nur77可以调节心肌中多种细胞的功能,例如:Nur77通过抑制炎性单核细胞的侵袭以及限制促炎因子的表达,在急性心肌梗死后的心肌纤维化中具有保护作用,Nur77抑制肾上腺嗜铬细胞中交感共递质NPY的表达和释放,导致Nur77-KO小鼠心肌肥大和纤维化。这些结果表明Nur77在多种病理生理过程中参与调节心肌功能和重塑,然而,Nur77在衰老相关心肌纤维化中的作用机制仍不清楚。本研究旨在通过建立Nur77敲除的自然衰老小鼠模型和Nur77过表达和低表达的心肌细胞模型,在体内实验观察Nur77对衰老小鼠心肌功能及结构、心肌病理组织学及纤维化相关指标的影响。在体外实验观察Nur77对心肌细胞纤维化的影响,并试图阐明Nur77影响心肌纤维化的机制。方法:第一部分:Nur77调控自然衰老小鼠心肌纤维化的作用研究1.将雄性Nur77基因敲除（Nur77-KO）小鼠及其野生对照（WT）同窝鼠饲养24个月,对6月龄（年轻）和15月龄（老年）,24月龄（超老年）WT和Nur77-KO小鼠进行超声心动图检测。2.处死小鼠,称量体重及心脏重量,HE,Masson,TUNEL染色检测小鼠心肌病理组织学改变,Western blot和q RT-PCR方法检测心肌肥大及纤维化相关指标的变化。第二部分:Nur77调控心肌细胞纤维化的作用研究1.体外培养大鼠心肌细胞系（H9c2）,用不同浓度TGF-β1刺激细胞24h,Western blot方法检测心肌细胞纤维化指标的变化,筛选合适的药物浓度。2.体外培养大鼠心肌细胞系（H9c2）,转染sh RNA对照慢病毒和Nur77 sh RNA慢病毒,转染完成后进行嘌呤霉素筛选构建低表达对照（Control）和Nur77低表达（sh-Nur77）稳转细胞系并应用Western blot和q RT-PCR方法验证细胞模型。3.体外培养大鼠心肌细胞系（H9c2）,转染对照慢病毒和Nur77过表达慢病毒,转染后进行嘌呤霉素筛选,构建过表达对照（Control）和Nur77过表达（Nur77）的稳转细胞系并应用Western blot和q RT-PCR方法验证细胞模型。4.PBS对照和TGF-β1（8ng/ml）处理过表达对照（Control）、Nur77过表达（Nur77）H9c2细胞及低表达对照（Control）、Nur77低表达（sh-Nur77）H9c2细胞24小时,应用Western blot和q RT-PCR方法检测各组细胞中纤维化标志物Col-1,α-SMA的蛋白和m RNA表达水平。第三部分:Nur77调控GSK-3β/β-catenin通路抑制心肌纤维化的机制研究1.通过Western bolt检测不同月龄WT及Nur77-KO小鼠心肌中GSK-3β/β-catenin信号通路的变化。2.在PBS对照和TGF-β1（8ng/ml）条件下处理低表达对照（Control）和Nur77低表达（sh-Nur77）H9c2细胞24小时,应用q RT-PCR和western bolt检测GSK-3β/β-catenin信号m RNA和蛋白表达水平的变化。3.在PBS对照和TGF-β1（8ng/ml）条件下处理过表达对照（Control）和Nur77过表达（Nur77）的稳转H9c2细胞24h,q RT-PCR和western bolt检测GSK-3β/β-catenin信号m RNA和蛋白表达水平的变化。4.H9c2细胞中,通过转染对照（Control）和GSK-3β小干扰RNA（si GSK-3β）构建GSK-3β低表达细胞模型,应用Western blot方法验证细胞模型。5.Nur77过表达的稳转细胞H9c2转染GSK-3βsi RNA48h,后TGF-β1（8ng/ml）处理细胞24小时,实验分组:CON;CON+TGF-β;Nur77+TGF-β;Nur77+GSK-3βsi+TGF-β。Western blot检测不同组中Col-1,α-SMA的蛋白表达,GSK-3β/β-catenin信号的变化。6.应用JASPAR网站预测Nur77结合序列元件在GSK-3β启动子区域的结合位点。7.应用Ch IP和荧光素酶报告实验检测Nur77对GSK-3β转录活性的调控作用。结果:第一部分:Nur77调控自然衰老小鼠心肌纤维化的作用研究1.与6m WT组相比,24m WT组小鼠左室舒张/收缩末期内径增大、舒张末期左心室后壁增厚,左室射血分数、缩短分数下降,舒张功能E/A比值降低。与6m WT组相比,15m WT组小鼠左室舒张末期内径增大、收缩末期左心室后壁增厚。与15m WT小鼠相比,15m Nur77-KO左室收缩/舒张末期内径增大、舒张/收缩末期左心室后壁增厚,左室射血分数、缩短分数及E/A比值显著降低。2.与15m WT小鼠相比,15m Nur77-KO小鼠的HW/BW比率显著增加。q RT-PCR结果显示,与15m WT小鼠相比,15m Nur77-KO小鼠心肌中脑利钠肽（BNP）、β-肌球蛋白重链（MHC）表达增加。3.与15m WT小鼠相比,15m Nur77-KO小鼠心肌TUNEL染色阳性细胞数量比率和Masson染色心肌纤维比例增加。4.与6m组WT小鼠相比,15m WT小鼠的心肌组织Col-1蛋白的表达明显增多。与15m WT小鼠相比,15m Nur77-KO小鼠心肌中Col-1,α-SMA蛋白的表达进一步增多。第二部分:Nur77调控心肌细胞纤维化的作用研究1.用不同浓度TGF-β1（0、2、8、40、80 ng/ml）刺激H9c2细胞24h,TGF-β1以浓度依赖的方式,使H9c2心肌细胞纤维化标志物Col-1表达增高。2.TGF-β1刺激降低Nur77在H9c2细胞中的表达,并可以增加H9c2细胞中α-SMA蛋白表达。无论是否存在TGF-β1刺激,Nur77敲减均可以显著增加H9c2细胞中Col-1的蛋白表达。3.TGF-β1刺激显著增加了H9c2细胞中纤维化标志物了Col-1,α-SMA的蛋白表达。PBS对照条件下,Nur77的过表达显著抑制H9c2细胞中Col-1表达,且降低TGF-β1刺激的H9c2细胞中纤维化标志物α-SMA的蛋白水平。第三部分:Nur77调控GSK-3β/β-catenin通路抑制心肌纤维化的机制研究1.与6m WT心肌相比,15m WT心肌中的β-catenin表达增加,GSK-3β表达减少;与15m WT小鼠相比,15m Nur77-KO进一步减少心肌中GSK-3β表达,增加β-catenin表达。2.在有或者没有TGF-β1刺激下,Nur77敲低均显著降低H9c2心肌细胞中GSK-3β的蛋白表达,并增加β-catenin的表达。3.无论是否存在TGF-β1刺激,Nur77过表达均导致H9c2中内源性GSK-3β表达增加,并在TGF-β1（8ng/ml）刺激条件下降低H9c2中β-catenin的蛋白表达。q RT-PCR结果显示,慢病毒介导的Nur77的过表达显著增加了心肌细胞H9c2中GSK-3βm RNA的表达,而对β-catenin m RNA水平几乎没有影响。4.TGF-β1刺激使心肌细胞中Col-1和α-SMA蛋白表达增加,Nur77过表达有效的抑制TGF-β1诱导的心肌细胞中Col-1和α-SMA蛋白表达增加,而GSK-3βsi RNA组Col-1和α-SMA蛋白表达的升高。同时,TGF-β1刺激使心肌细胞中β-catenin蛋白表达增加,Nur77的过度表达增加心肌细胞中GSK-3β的表达,使β-catenin蛋白表达减少,而si RNA介导GSK-3β的敲减导致β-catenin的表达增加。5.JASPAR网站预测在GSK-3β的转录起始位点前有3个能和Nur77结合的作用位点,分别是-1441,-144,-26。6.Ch IP和荧光素酶报告实验结果提示Nur77能够和GSK-3β转录起始位点前的DNA序列结合,增加GSK-3β转录。结论:第一部分:Nur77调控自然衰老小鼠心肌纤维化的作用研究1.敲除Nur77加重衰老小鼠心肌结构异常及舒缩功能障碍;2.敲除Nur77加速衰老小鼠心肌细胞肥大和心肌纤维化发病进程。第二部分:Nur77部分抑制TGF-β诱发的H9c2细胞纤维化。第三部分:Nur77调控GSK-3β/β-catenin通路抑制心肌纤维化的机制研究1.Nur77通过激活GSK-3β,抑制β-catenin介导的心肌纤维化。2.Nur77是GSK-3β上游核转录因子,通过转录调控GSK-3β抑制心肌纤维化。