背景:植入电子起搏器已成为治疗症状性缓慢性心律失常的首选方法,并取得很大的成功。然而,有限的电池寿命、缺乏对神经激素自动反应性、儿童期植入起搏器后电极不能随身体的发育而相应变长等缺点使得人们迫切需要一种更理想的治疗方法。国内外的学者研究认为利用基因治疗和细胞治疗构建生物起搏在不久的将来可能会成为电子起搏器最为理想的替代方法。然而目前有关生物起搏的体内实验都没有超过2周,这是否与目前研究者所选用的基因以及基因载体有关?慢病毒表达系统因其基因组可以整合于宿主基因组中,长时间、稳定表达外源基因并具有较低的免疫原性,受到广泛关注。所以本实验我们使用5-aza（5-氮胞苷）诱导骨髓干细胞向心肌样细胞转化,同时将HCN4（hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated,超极化激活环核苷酸门控）起搏基因使用慢病毒转染进心肌样骨髓基质干细胞,观察在体外能否构建生物起搏细胞,并能长期表达,从而为进一步在体研究生物起搏打下基础。第一部分猪骨髓间充质干细胞（MSCs）的分离、培养及5-aza诱导其转化为心肌样细胞的研究第一节猪骨髓间充质干细胞（MSCs）的分离、培养目的:建立猪骨髓间充质干细胞体外培养方法,为5-aza诱导转化为心肌样细胞提供材料。方法:猪的骨髓MSCs分离纯化后,流式细胞仪检测细胞周期。结果:体外培养的原代MSCs 10～14d达到融合,细胞周期显示73%的细胞处于G₀/G₁期。结论:根据黏附特性分离的猪骨髓MSCs在体外条件下可生长扩增,可用于5-aza诱导转化为心肌样细胞。第二节5-aza体外诱导MSCs分化为心肌样细胞的研究目的:建立猪骨髓间充质干细胞体外转化为心肌样细胞的方法,为构建生物起搏细胞提供新材料。方法:猪的骨髓MSCs分离纯化后,用5-aza诱导后,用抗结蛋白（desmin）、肌球蛋白重链（MHC）、心肌特异性肌钙蛋白I（cTnI）、连接蛋白-43（Cx-43）进行免疫细胞化学染色鉴定。结果:体外培养的第二代MSCs经5-aza诱导后,部分MSCs呈梭形,阳性表达desmin、MHC、cTnI和Cx-43。结论:根据黏附特性分离的猪骨髓MSCs在体外条件下可分化为心肌样细胞,可用于构建生物起搏细胞。第二部分穿梭质粒pCDH1-GFP-HCN4的构建及HCN4重组慢病毒的包装第一节穿梭质粒pCDH1-GFP-HCN4的构建目的:将全长约3.6kb的hHCN4目的基因片段从Dr Stieber教授惠赠的pCDNA3-hHCN4质粒卸载下来,最终装载到带有GFP绿色荧光蛋白标记的去内毒素穿梭质粒pCDH1-MCS1-EF1-copGFP上。方法:用Eco RI和XbaⅠ从pCDNA3-hHCN4质粒切下hHCN4目的片段连接到Puc19载体中,再用EcoRI和HindⅢ从质粒Puc19切下目的片段连接到pcDNA3.1（A）载体中,再用XbaⅠ单酶从质粒pcDNA3.1（A）双切到pCDH1-MCS1-EF1-copGFP中。用XbaⅠ或者Eco RI鉴定,将阳性克隆质粒送上海生工测序,并将构建的目的基因质粒转染293细胞和猪骨髓间充质干细胞。结果:XbaⅠ及Eco RI鉴定表明,PCR的产物和克隆扩增的产物的电泳结果该基因的大小约为3.6kb;阳性克隆质粒测序结果与GENEBANK目的基因HCN4序列完全相同;构建的目的基因质粒转染293细胞和原代的猪骨髓间充质干细胞后,均发现有强烈的绿色荧光的出现。结论:成功将全长hHCN4目的基因片段从pCDNA3-hHCN4质粒卸载下来,装载到去内毒素穿梭质粒pCDH1-MCS1-EF1-copGFP上,可用于下一步慢病毒的包装。第二节HCN4重组慢病毒的包装目的:使用慢病毒包装系统（pPACKH1-Lentivector Packaging Kit）建立稳定的HCN4重组慢病毒。方法:实验过程参照SBI的Lentivector Expression System的操作手册进行。将构建好的慢病毒包装质粒混合物混合后感染293T细胞及心肌样骨髓基质干细胞。结果:构建的慢病毒包装质粒混合物转染293细胞和心肌样猪骨髓间充质干细胞后,均发现有强烈的绿色荧光的出现,细胞感染效率可以达到90%以上。结论:成功建立稳定的hHCN4重组慢病毒,该病毒载体有很高的转染效率。第三部分慢病毒转染基质干细胞构建起搏样细胞的体外研究目的:使用hHCN4重组慢病毒载体转染心肌样骨髓基质干细胞获得稳定过表达HCN4基因的起搏样干细胞。方法:慢病毒转染心肌样骨髓基质干细胞实验过程参照SBI的LentivectorExpression System的操作手册进行;稳定转染细胞继续培养两周后行Western blot鉴定蛋白的表达并行real-time RT-PCR实时荧光定量检测HCN4目的基因的表达情况;全细胞膜片钳记录转染细胞HCN4通道电流的表达;转染细胞体外长期培养观察细胞的转染状态。结果:病毒感染48小时后,目的细胞出现大量的荧光;Western blot检测结果见图,可见一约170kDa条带,与克隆hHCN4通道蛋白分子量相符;RT-PCR显示慢病毒转染的细胞hHCN4-RNA是原代细胞的123倍;膜片钳记录在转染细胞中可记录到明显的电压与时间依赖性的超极化内向电流,即If电流;将转染的心肌样骨髓基质干细胞培养至2个月时,显微镜下发现细胞呈群体性搏动,20℃室温下的搏动频率为15±1次/分。该病毒载体有很高的转染效率,在体外已获得至少8个月的阳性表达,8个月后因为细胞污染未进一步观察。结论:hHCN4重组慢病毒转染心肌样骨髓基质干细胞获得了稳定过表达HCN4基因的起搏样干细胞。这种基因修饰后的心肌样干细胞有可能成为一种有效的生物起搏种子细胞,并期待在缓慢性心律失常的治疗技术上实现新突破。第四部分稳定转染hHCN4起搏通道亚型的电生理特点目的:全细胞膜片钳技术记录稳定转染pCDH1-GFP-HCN4的心肌样骨髓基质干细胞,了解hHCN4起搏通道亚型的电生理特点。方法:全细胞膜片钳技术记录稳定转染pCDH1-GFP-HCN4的心肌样骨髓基质干细胞,观察hHCN4通道电流、通道电流激活曲线及电压依赖性激活时间常数动力学曲线;改变细胞外液K⁺、Na⁺浓度,观察K⁺、Na⁺对I_hHCN4电流的影响;以河豚毒素(TTX,I_Na阻断剂)、四乙胺（TEA,I_K阻断剂）、环磷酸腺苷（cAMP）、异丙基肾上腺素（ISO）、乙酰胆碱（Ach）、铯（Cs⁺）、ZD7288（If电流特异性阻断剂）和胺碘酮分别灌流,观察它们对I_hHCN4电流的影响。结果:1.大多数稳定转染的心肌样骨髓干细胞可记录到约-80mV开始激活的一系列超极化内向离子流(I _hHCN4电流,该电流激活缓慢,呈电压、时间依赖性。电流的激活电位(V_th)、半最大激活电位(V_1/2)分别为-83±8mV、-108±2mV,斜率为-11.2±0.6 mV（n=10）。钳制电压-140mV时,激活时间常数为0.66±0.1s;钳制电压-110mV时,激活时间常数为3.1±0.7s。I_hHCN4的反转电位21.2±2.3mV（n=10）,P_Na/P_K为0.23。2.钳制电位-140mV,外液K⁺浓度30 mmol/L,Na⁺浓度由110 mmol/L降为50mmol/L,I_hHCN4电流密度分别为-300±25pA/pF^-1、-87±10 pA/pF^-1（n=8,p＜0.001）,减少73%;外液Na⁺浓度110 mmol/L,K⁺浓度由30 mmol/L降为5 mmol/L,I_hHCN4电流密度分别为-302±30pA/pF^-1、-244±19 pA/pF^-1（n=8,p＜0.05）,减少20%。3.TTX和TEA灌流10min,对I_hHCN4没有影响。4.1mmol/L cAMP灌流10min,I_hHCN4无明显变化,电极内液中加入终浓度为1mmol/L的cAMP,I_hHCN4激活加快,激活时间加快,V_1/2由-109±2mV变为-92±2mV,向正向移动17mV（n=10,p＜0.05）,激活阈值及最大激活电流没有明显改变5.1μmol/L ISO灌流10min,I_hHCN4略加快。1μmol/L Ach灌流10min,I_hHCN4无明显改变。6.低浓度Cs⁺可阻滞I_hHCN4,冲洗后抑制作用完全恢复,半效抑制浓度（IC50）为128.8±28.1μmol/L;较低浓度ZD7288可阻滞I_hHCN4,冲洗后抑制作用不能恢复,IC50为23.8±5.7μmol/L。7.胺碘酮可阻滞I_hHCN4,冲洗后抑制作用无明显恢复,IC50为1.34±0.33μmol/L;胺碘酮使各钳制电压下I_hHCN4激活缓慢。结论:重组HCN4慢病毒转染心肌样干细胞,其表达的I_hHCN4电流具有天然If电流特点,表现为电压与时间依赖性的超极化内向电流、cAMP直接激活、Na⁺/K⁺离子混合通透,Cs⁺、ZD7288可以阻断I_hHCN4;胺碘酮可以抑制I_hHCN4,这些不仅为起搏通道HCN4基因治疗缓慢性心律失常提供理论基础,同时也为胺碘酮治疗由于起搏电流异常增加所致的快速型心律失常提供实验依据。