第一章口腔黏膜下纤维性变新靶标分子的定量分析研究研究目的:(1)在前期实验建立的口腔黏膜下纤维性变[oralsubmucous fibrosis(OSF)]颊黏膜与口腔正常颊黏膜[normal buccalmucosa(NBM)]差异基因表达谱中筛选出显著性更强的差异基因,并在其中选取3个上调差异变化最大的基因和2个下调差异变化最大的基因作为OSF候选靶标基因;(2)分别研究5个候选基因在OSF颊黏膜和正常颊黏膜中mRNA和蛋白水平的定量表达差异,并以此验证基因芯片结果的准确性。研究方法:(1)将前期试验建立的15339个OSF差异表达基因(8184个上调基因和7155个下调基因)以差异倍数变化值[foldchange value(FCV)]从大至小排序,同时以上调基因FCV大于2、下调基因FCV小于0.5、显著性差异值q小于0.01为标准筛选出显著性差异基因,并在其中选取3个上调FCV最大和2个下调FCV最小的基因作为候选基因;再对筛选的显著性差异基因进行分层聚类分析[hierarchical clustering analysis(HCA)];(2)将OSF颊黏膜和正常颊黏膜组织标本提取总mRNA后,利用逆转录聚合酶链反应[reverse transcriptase-PCR(RT-PCR)]方法研究5个候选基因在其中的mRNA表达差异,并对基因芯片结果进行验证;(3)将OSF颊黏膜和正常颊黏膜组织标本提取总蛋白后,利用Western blotting方法研究5个候选靶标蛋白在其中的蛋白表达差异。研究结果:(1)最终共筛选出790个显著性差异基因,其中上调基因661个、下调基因129个;3个上调FCV最大的基因分别是:兜甲蛋白[loricrin(LOR)]基因、软骨寡聚基质蛋白[cartilage oligomericmatrix prorein(COMP)]基因和趋化因子9[Cys-X-Cys ligand 9(CXCL9)]基因;2个下调FCV最小的基因分别是:角蛋白[keratin 19(KRT19)]基因和细胞色素450 3A5[cytochrome P450 3A5(CYP 3A5)]基因;分层聚类分析结果显示这些显著差异基因能有效区分OSF颊黏膜组织和正常颊黏膜组织;(2)RT-PCR结果显示:LOR、COMP和CXCL9基因在OSF组中的mRNA表达水平明显高于正常组(P＜0.05);KPT19和CYP 3A5基因在OSF组中的mRNA表达水平明显低于正常组(P＜0.05),从而验证了基因芯片结果的准确性;(2)Western blotting结果显示:COMP和CXCL9在OSF组中的蛋白表达水平明显高于正常组(P＜0.05);KRT19和CYP 3A5在OSF组中的蛋白表达水平明显低于正常组(P＜0.05);而由于LOR本身具有极度难溶的特性,本次实验并没有得到LOR在两组具有统计学意义的差异表达。研究结论:(1)OSF的致病机理是一个多因素、多步骤的复杂过程,众多不同的相关基因参与其中;而在本研究中最值得关注的5个基因分别与OSF组织细胞物理防御能力、胶原合成、炎症细胞趋化、上皮细胞更新能力和细胞毒物代谢能力5种重要细胞功能紧密相关;(2)5个候选基因在OSF组织中的转录水平和翻译水平(除LOR外)均显著不同于正常颊黏膜组织,并且差异趋势与基因芯片结果一致,提示这些基因确实在OSF发病致病过程中发挥了重要作用,同时也验证了前期试验基因芯片结果的准确性。第二章口腔黏膜下纤维性变新靶标蛋白免疫组织化学定性分析研究目的:(1)研究5个候选靶标蛋白在OSF颊黏膜中的组织分布和细胞定位;(2)分析该5个候选靶标蛋白在OSF中的表达与患者临床病理参数的关系,并探讨它们两两之间的表达关联。研究方法:(1)收集66例OSF颊黏膜和14例正常颊黏膜组织石蜡标本,利用免疫组织化学技术[immunohistochemistry(IHC)]将5个候选靶标蛋白分别与其对应的抗体结合并显色,然后在显微镜下分别观察5种蛋白在OSF组织或正常颊粘膜组织中的组织分布和细胞定位;(2)利用卡方检验计算5个靶标分子在OSF组织中的阳性染色率与患者临床病理参数的相关性,并计算它们两两之间表达关联的方向及强度。研究结果:(1)LOR在正常颊黏膜中呈阴性表达;而在42例(63.6%)OSF颊黏膜棘层上部和(或)表层的细胞胞浆和(或)胞核中呈棕黄色阳性染色;(2)COMP在正常颊黏膜中呈阴性表达;而在36例(54.5%)OSF组织固有层和(或)黏膜下层呈强阳性表达;(3)CXCL9在正常组中呈阴性表达;而在43例(65.2%)OSF组织固有层和黏膜下层淋巴细胞和内皮细胞胞浆中呈强阳性表达;(4)14例(100%)正常颊黏膜基底细胞胞浆均呈KRT19强阳性表达;只有7例(10.6%)OSF基底细胞呈现KRT19弱阳性表达,其余为阴性;(5)CYP 3A5在12例(85.7%)正常颊黏膜棘细胞胞膜和(或)胞浆,以及14例(100%)正常颊黏膜内皮细胞胞浆中呈阳性表达;其只在5例(7.6%)OSF颊黏膜上皮棘细胞和33例(50%)OSF颊黏膜粘膜下层内皮细胞中呈弱阳性表达,其余为阴性表达。(6)LOR在中期OSF组织中的阳性表达率显著高于早期(P＜0.05);COMP阳性表达率与咀嚼槟榔时间(P＜0.05)和病理分期(P＜0.05)正相关;而CYP 3A5阳性表达率与OSF组织病理分期呈负相关(P＜0.05);5个候选靶标蛋白中只有COMP阳性表达率与CYP 3A5阳性表达率之间存在具有统计学意义的负相关性(P＜0.05),关联强度r=—0.24。研究结论:5个候选靶标分子分别定位于OSF颊黏膜上皮层和黏膜下层,能够有助于解释OSF特征性病理改变形成的机制,并且提示黏膜上皮层某些特异分子的表达改变在OSF致病过程中同样发挥了重要作用。