【摘 要】
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目的:实验室通过家系调查和致病基因筛查,发现了一个携带PCDH15和CDH23双基因杂合变异的耳聋家系,本实验对该家系中发现的变异位点进行功能研究,初步探讨双基因变异的致病性。方法:收集该家系中所有成员的血液标本,应用全外显子测序技术和Sanger测序进行致病基因检测和分析;然后通过生信分析及蛋白保守性分析预测变异的致病性;构建PCDH15和CDH23野生型（WT）及突变型（MT）真核表达载体,应
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目的:实验室通过家系调查和致病基因筛查,发现了一个携带PCDH15和CDH23双基因杂合变异的耳聋家系,本实验对该家系中发现的变异位点进行功能研究,初步探讨双基因变异的致病性。方法:收集该家系中所有成员的血液标本,应用全外显子测序技术和Sanger测序进行致病基因检测和分析;然后通过生信分析及蛋白保守性分析预测变异的致病性;构建PCDH15和CDH23野生型（WT）及突变型（MT）真核表达载体,应用Western blot、免疫荧光技术检测基因变异是否会影响其编码蛋白的表达及细胞定位;利用实时荧光定量PCR（q PCR）技术检测与目的基因相互作用的基因（Harmonin、PIST、PDZD7和Whirlin）的表达情况;同时构建PCDH15和CDH23野生（WT）及突变型（MT）原核表达载体,以便日后对双基因变异的致病机制进行进一步研究。结果:1.测序结果显示三名患者（Ⅱ-2,Ⅱ-3和Ⅱ-4）同时携带PCDH15 c.4765del C/（p.Leu1589Serfs*13）和CDH23 c.9617G>A（p.Arg3206His）双基因杂合变异,父亲（Ⅰ-1）携带PCDH15 c.4765del C/（p.Leu1589Serfs*13）单基因杂合变异,母亲（Ⅰ-2）和大女儿（Ⅱ-1）携带CDH23 c.9617G>A（p.Arg3206His）单基因杂合变异,符合家系共分离原则。2.蛋白保守性分析表明Leu1589和Arg3206在各个物种中高度保守;生物信息学分析结果显示表明PCDH15 c.4765del C和CDH23 c.9617G>A两个变异致病性很强。3.Western blot结果表明,PCDH15变异产生了截短蛋白,而且会导致蛋白表达量降低甚至不表达;CDH23野生型和突变型蛋白表达量没有明显变化。4.免疫荧光结果显示,PCDH15和CDH23基因变异没有改变目的蛋白的定位,但是在突变体转染的细胞胞质内观察到了蛋白聚集的现象。5.q PCR结果表明,相比PCDH15-WT,在PCDH15-MT转染的细胞内检测到Whirlin、PIST基因表达量无明显变化,而Harmonin、PDZD7表达量降低,说明PCDH15变异会使Harmonin和PDZD7的表达量降低;相对于CDH23-WT,在CDH23-MT转染的细胞内,Whirlin、PIST、Harmonin和PDZD7表达量均无明显变化,说明CDH23基因的变异不会影响互作基因的表达。6.利用原核细胞进行蛋白表达,结果表明PCDH15不能在BL21（DE3 pLysS）中表达,而CDH23可以利用BL21（DE3 pLysS）进行表达,且CDH23-MT没有影响蛋白的表达,除此以外我们拟利用原核表达获取蛋白以便后续研究。结论:应用分子生物学技术和细胞学实验证实了PCDH15和CDH23双基因杂合变异可能是该家系的致聋原因。
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