论文部分内容阅读
1．分别以4种不同基因型和亚型的HEV ORF2(452～617aa)基因工程表达蛋白作为包被抗原，包括基因Ia型的缅甸株(p166Bur)、基因Ib型的巴基斯坦株(p166Pak)、基因Ⅱ型的墨西哥株(p166Mex)和基因Ⅲ型的美国株(p166Us)，以HRP标记的SPA(HRP-SPA)代替酶标抗体作间接ELISA来检测猪血清中的HEVIgG，筛选灵敏度相对较高的HEV抗原用于猪HE血清流行病学调查。检测75份猪血清，p166Us抗原的阳性检出率58／75(77.3％)，高于p166Pak43／75(57.3％)、p166Mex27／75(36％)和p166Bur20／75(26.7％)，而且p166Us可以检测到的抗体滴度最高。从而在猪HE血清流行病学调查中，选择p166Us(约30ng／孔)为包被抗原，HRP-SPA(1：40)代替酶标抗体，对猪血清进行1：20稀释，检测猪血清中HEV IgG。 2．用戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)美国株ORF2中和抗原表位(452-617aa)的基因工程表达产物作为包被抗原，对采自新疆南部和北部地区9个猪场的813份1-12月龄猪血清样品进行酶联免疫吸附试验，测定HEV IgG，以调查人戊型肝炎新疆疫区猪HEV的感染状况。结果表明，1998-1999年组阳性率50.62％(205／405)；2002年组阳性率58.33％(238／408)，总阳性率52.55％(443／813)。不同猪场的阳性率不同，从42.42-89.47％不等，所采猪种为约克夏、大约克夏、杜洛克和长白。抗体阳性率与地理位置和猪品种差异不显著(P＞0.05)，而与年龄呈极显著相关(P＜0.01)，3月龄以下猪阳性率40％(84／210)，3月龄以上猪阳性率77.33％(133／172)。提示在新疆南北普遍存在猪感染HEV的情况，且阳性率的高低与采样猪的年龄有正相关性。 3．采集新疆第一猪场猪粪便70份，第二猪场60份，南京红山动物园野生动物粪便24份，安徽某狐狸厂狐狸粪便10份，利用逆转录套式聚合酶链方法(RT-nPCR)，检测HEv RNA，将PCR扩增产物克隆到pMD18-T载体上，构建成重组质粒并测序，利用生物学软件进行序列分析和进化树绘制。结果表明，第一猪场13份为阳性，阳性率18.57％；第二猪场42份为阳性，阳性率70％；野生动物和狐狸均为阴性。第一猪场13株猪源HEV分离株在HEV ORF2 348bp核苷酸序列的同源性为97.1％-100％，第二猪场测序7株，ORF2 348bp核苷酸序列的同源性为98.6％～100％，20株分离株马勋:新班猪戊型肝炎的血清流行病学调查及病毒的基因型分析之间同源性89.7洲卜口100%，为同一基因型;与HEVI一m同源性分别为75.9%~80.2%，76.3%、78.0%和76.2%~81.7%，与HEVW型同源性为84.0恻卜91.1%.以该核普酸片段绘制的基因进化树显示20株猪HEV都与HEV WTI株在同一分支上，属基因W型;但来自同一猪场的毒株聚集在一起，形成独立的分支.该20株猪HEV与国内其他猪HEV该片段核普酸序列同源性为83.7%~92%，提示中国大陆猪源HEV的基因型比较一致，同属HEVW型. 4.设计18对PCR引物分片段扩增猪戊型肝炎病毒新脸分离株swCH25全基因，对两末端采用末端快速扩增方法(RAcE)进行扩增，扩增产物克隆到pMD18~T载体并测序.用DNASTAR软件进行序列同源性分析，PHYLIP软件绘制基因进化树，在全基因序列的基础上比较猪HEV与其他HEV基因型的差异和人源HEV的关系.结果显示swCH25全序列除去3’poly(A)尾，由7243个核普酸组成，ORFI一3分别编码含1707，674和114个氮基酸的蛋白质.全基因序列与HEVI、n和m型同源性73.5%~75.7%，与W型的同源性为83.5%~89.8%，其中与IV型中国人源T1株最高，达89.8%.0灯1与I一m和W型的核普酸同源性分别为71.6%匀74%和82.30/r.89.4%，氛基酸同源性为80.7%~86.1%和94.3%~96.0%;ORFZ与I一m和W型的核普酸同源性分别为78.4%~81 .3%和87.1%~90.9%，氛基酸同源性为89.7%~93.8%和97.2叹产98.2%;ORF3与I一m和W型的核普酸同源性分别为84.4%、87.3%和95.4~%.8%，孰基酸同源性为74.8%~83.2%和93.8%~97.4%渗因进化树显示swCH25与基因W型人源Tl株最接近，在同一分支上.swCH25株是国内第一个测出全基因序列的猪戊型肝炎病毒. 5.对基于O盯2部分序列确定为基因W的5株猪HEV毒株高变区进行了Rl’- nPCR的扩增和序列的测定，用DNAStar软件进行序列的比对、同源性计算和基因进化树的绘制，探讨高变区在HEV基因分类中的地位.分析结果表明5株猪HEV高变区核普酸同源性为80.3叹产98.6%，氛基酸同源性在79.80/卜99.2%，变异较大，进一步印证了高变区的存在.对高变区序列比对和同源性分析，发现基因型内分离株序列变异程度低于型间的变异，基于高变区的分型结果与全基因序列的分型结果一致，即各病毒株所归属的基因型并未改变.提示在基因型已确定情况下，对同一基因型内相近分离株，可以根据高变区的比较来进行亚型的分类.因此，基于高变区的比较，基因I，m，W型可分为3，6和6个亚型.本实验获得的5株猪HEV中swCHllO，swCH22，swCH25，swCH57归属Wb亚型，swCH23属于Wa亚型，基因进化树上形成两个独立的分支.