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目的:Fezf2(Fez家族锌指蛋白2),选择性地表达于大脑皮质第Ⅴ和Ⅵ皮层的下行性投射神经元以及其前体细胞中。近来研究证实,对于皮质下轴突投射的形成和定向发育方面都起着非常重要的作用。本研究将首先探明Fezf2蛋白在小鼠大脑皮质神经元发育中的亚细胞定位,之后利用分子生物学方法,找到Fezf2蛋白的核定位信号序列,以便将来研究Fezf2入核行为对深皮质神经元形成的调控作用。
方法:1.通过胚胎内基因电穿孔技术将Fezf2-GFP融合蛋白的表达载体在E13.5(深皮层神经元产生时期)时导入小鼠胚胎侧脑室,模仿其在体表达,同时联合E10.5的皮层原代培养细胞的免疫荧光共定位,以及在体外N2a细胞和293T细胞上进行转染,观察Fezf2的亚细胞定位；
2.从新生B6小鼠脑组织的cDNA文库中采用PCR的方法扩增Fezf2全长及实验所需各缺失片段,并进行克隆,形成GFP-Fezf2融合蛋白,表达于N2a细胞和293T细胞中,通过观察GFP绿色荧光所在的亚细胞定位,筛选出Fezf2的潜在核定位信号序列；
3.扩增筛选出来的潜在核定位信号序列,以相同手法研究其对该蛋白入核的充分性；
4.应用QuikChange()Ⅱ XL Site-Directed Mutagenesis Kit,对Fezf2全序范围内的碱性氨基酸组合进行突变,找出核定位信号中关键的氨基酸。
结果:1.在胚胎10.5小鼠的大脑皮质神经元原代培养的细胞上,以及在体外培养的神经类细胞(N2a)和非神经类细胞(293T)中转染结果发现,Fezf2限制分布在细胞核内；
2.在小鼠E13-5进行胚胎基因转染,将GFP-Fezf2导入深皮质神经元前体细胞中,在E15.5荧光观察显示,Fezf2表达于深皮质神经元细胞核内；
3.通过一系列克隆及转染结果,筛选得到了Fezf2潜在的非典型的核定位信号序列,碱基序列为953-1124；
4.单独扩增上述Fezf2潜在的核定位信号序列,进行转染发现,其对于入核行为关键但不充分。扩大扩增片段范围,找到了对入核行为起充分作用的片段,碱基序列为704-1132；
5.通过分子克隆形成GFP-Fezf2和GFP-Fezf2-GFP融合蛋白,增大Fezf2蛋白的分子质量,使其超过自由扩散入核的质量上限,在N2a细胞上进行转染后发现,均定位于核内,说明Fezf2蛋白是通过其核定位信号经主动运输入核；
6.对Fezf2全序范围的相邻及相隔碱性氨基酸组合进行突变,发现将位于318位的碱性氨基酸组氨酸(H)突变成中性氨基酸(L)后,该蛋白无法限制性分布在核内。
结论:1.Fezf2在小鼠中自E10.5的侧脑室前体细胞中开始至新生早期,一直定位于细胞核中；
2.Fezf2含有主动入核的多肽,可以将大分子(俩个GFP)带入核内；
3.在Fezf2基因中,位于704-1132的碱基序列,对应第219-362位的氨基酸序列对于入核行为起到关键作用；
4.318位的组氨酸(H)是入核所必需的。