论文部分内容阅读
莴苣(Lactuca sativa L.)是菊科莴苣属草本植物,是一种重要的蔬菜作物,种植常采用播种的方式。有研究表明,莴苣种子的萌发需要胚根伸长生长和胚乳弱化同时起作用,而在胚根伸长和胚乳弱化过程中,活性氧(Reactive oxygen species,ROS)起着至关重要的作用。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)是与ROS代谢密切相关的酶,广泛存在于动物、植物、微生物中。目前,SOD基因与种子萌发的关系还不清楚。本文以莴苣种子为材料,测定种子在水和脱落酸(Abscisic acid,ABA)中吸涨时,胚根及胚乳帽中SOD的活性,并从吸涨种子中克隆了两个SOD基因,LsSOD1和LsSOD2,检测了水和ABA中吸涨的莴苣种子胚根及胚乳帽中LsSOD1和LsSOD2的转录水平,并构建过表达载体,使用农杆菌介导法进行遗传转化,获得了过表达LsSOD1和LsSOD2的转基因植株。主要研究结果如下:(1)利用氯化硝基四氮唑蓝光还原法,检测了种子分别在水和ABA中吸涨时胚乳帽和胚根中SOD的活性。结果表明,水中吸涨的种子,在开始有种子完成萌发的时间点(15 h)前,胚乳帽和胚根中SOD活性均有所增加,吸涨15-17 h,胚乳帽和胚根中SOD活性有小幅增加,吸涨17-21 h,胚乳帽中SOD活性仍小幅增加,但胚根中SOD活性显著降低;在10 mg/L ABA溶液中吸涨的种子,吸涨13-17 h,胚乳帽及胚根中SOD活性均有所下降,吸涨17-21 h,胚乳帽中SOD活性显著升高,胚根中SOD活性有所降低。总体而言,在10 mg/L ABA溶液中吸涨各时间点的胚乳帽和胚根中SOD的活性均比水中吸涨的高。(2)利用反转录聚合酶链式反应以及快速扩增cDNA末端技术,从莴苣种子中克隆到2个SOD基因:LsSOD1和LsSOD2。(3)采用实时荧光定量技术分析了种子在水和ABA中吸涨时胚乳帽及胚根中的LsSOD1和LsSOD2的表达水平。结果表明,两个基因在胚乳帽及胚根中的相对表达量有差异。水中吸涨13-15 h的胚乳帽和胚根中,LsSOD1和LsSOD2的表达水平都大幅增加,吸涨15-17 h之间,胚乳帽中LsSOD1和LsSOD2及胚根中LsSOD2的表达水平均大幅减少,胚根中LsSOD1的表达水平小幅增加,吸涨17-21 h的胚乳帽和胚根中,LsSOD1和LsSOD2的表达水平均有所增加;10 mg/L ABA中吸涨13-21 h的胚乳帽和胚根中,LsSOD1的表达水平变化不大,但在吸涨15 h时均有一个峰值,LsSOD2的表达水平持续下降。(4)构建了35S组成型启动子过表达载体pBI1.4-LsSOD1和pBI1.4-LsSOD2,诱导型启动子过表达载体pER8-LsSOD1和pER8-LsSOD2,并用农杆菌介导遗传转化技术侵染莴苣子叶外植体,得到部分阳性转基因植株,目前转基因植株正在种植中。从酶活性和基因转录水平的变化上看,SOD可能在莴苣种子萌发时的胚乳弱化及胚根伸长过程中发挥了一定的作用。